1、目的:
　　三氧化二砷(As2O3)是治療對維A酸耐藥的復(fù)發(fā)急性早幼粒細胞白血病的有效、安全的藥物,完全緩解(CR)率高,其藥理主要作用于PML/RARa融合蛋白,是通過誘導(dǎo)分化和促使癌細胞凋亡而達到治療的目的。但是臨床上As2O3存在早期誘導(dǎo)分化階段白細胞數(shù)急劇增長,白血病細胞的浸潤增加了病人治療的危險性。有學(xué)者認為白血病細胞浸潤現(xiàn)象與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VE

2、GF)有關(guān),VEGF是調(diào)節(jié)血管生成的最重要的細胞因子,VEGF和它的受體(Flt-1)結(jié)合刺激腫瘤血管內(nèi)皮細胞形成新生血管,與多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal proteinases, MMPs)是一系列蛋白水解酶,在腫瘤侵襲和復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用,MMP-9通過降解Ⅳ型膠原酶促進細胞外基質(zhì)重塑并破壞基底膜以促進血管形成,MMP-9能夠上調(diào)VEGF的表達。Survivin基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種抑

3、制凋亡新基因,屬于凋亡蛋白抑制家族(inhibitor of apoptosis protein, IAP)成員,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要作用。丙戊酸鈉(valproic acid, VPA)是臨床上廣泛應(yīng)用的廣譜抗癲癇藥,可阻滯腫瘤細胞的細胞周期并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,促進腫瘤細胞自我吞噬。近年來發(fā)現(xiàn)其可通過阻礙血管生成而達到治療腫瘤的目的。本實驗探討VPA聯(lián)合不同濃度As2O3對t(15,17)APL細胞株NB4細胞血管新生相

4、關(guān)因子表達的影響。
　　方法:
　　NB4細胞培養(yǎng),實驗分不同濃度的As2O3即0、0.1、0.5、1.0、2.0μmol/L及不同濃度As2O3聯(lián)合VPA共10組,利用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞毒性反應(yīng),采用RT-PCR方法檢測細胞VEGF/Flt-1、MMP-9及Survivin mRNA的表達。Western Blot方法檢測VEGF及Survivin蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1不同處理組對NB

5、4細胞株存活率的影響
　　MTT結(jié)果顯示,單用As2O3組隨著As2O3濃度的增加,細胞存活率依次降低,差異具有顯著性(P<0.05);而As2O3聯(lián)合VPA組均較單用As2O3組細胞存活率下降,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異具有顯著性(P<0.05);不同濃度As2O3聯(lián)合VPA組間進行統(tǒng)計分析(P>0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2不同濃度AS2O3對NB4細胞VEGF基因及蛋白表達的影響
　　2.1經(jīng)半定量RT-PCR分析,

6、0.1、0.5、1.0μmol/L As2O3組與對照組相比VEGF mRNA表達增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.0μmol/L As2O3組與對照組相比VEGF mRNA表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.2經(jīng)Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn),0.1、0.5、1.0μmol/L As2O3組與對照組相比VEGF蛋白表達增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.0μmol/L As2O3組與對照組相

7、比VEGF蛋白表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3不同濃度AS2O3對NB4細胞Flt-1基因表達的影響
　　經(jīng)半定量RT-PCR分析,0.1、0.5、1.0μmol/L As2O3組與對照組相比Flt-1 mRNA表達增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.0μmol/L As2O3組與對照組相比Flt-1 mRNA表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4不同濃度As2O3對NB4細胞

8、MMP-9基因表達的影響
　　經(jīng)半定量RT-PCR分析,0.1、0.5、1.0μmol/L As2O3組與對照組相比MMP-9 mRNA表達增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.0μmol/L As2O3組與對照組相比MMP-9 mRNA表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5 VPA聯(lián)合As2O3與單用As2O3對NB4細胞VEGF基因及蛋白表達的影響
　　5.1經(jīng)半定量RT-PCR分析,VPA聯(lián)合

9、不同濃度As2O3組與單用As2O3組比較VEGF mRNA表達均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.2經(jīng)Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn),VPA聯(lián)合不同濃度As2O3組與單用As2O3組比較VEGF蛋白表達均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　6 VPA聯(lián)合As2O3與單用As2O3對NB4細胞Flt-1基因表達的影響
　　經(jīng)半定量RT-PCR分析,VPA聯(lián)合不同濃度As2O3組與單用As2O

10、3組比較Flt-1 mRNA表達均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　7 VPA聯(lián)合As2O3與單用As2O3對NB4細胞MMP-9基因表達的影響
　　經(jīng)半定量RT-PCR分析,VPA聯(lián)合不同濃度As2O3組與單用As2O3組比較MMP-9 mRNA表達均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　8不同濃度As2O3對NB4細胞Survivin基因及蛋白表達的影響
　　8.1經(jīng)半定量RT-PCR分析

11、,不同濃度As2O3組與對照組相比Survivin mRNA表達均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　8.2經(jīng)Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn),不同濃度As2O3組與對照組相比Survivin蛋白表達均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　9 VPA聯(lián)合As2O3與單用As2O3對NB4細胞Survivin基因及蛋白表達的影響
　　9.1經(jīng)半定量RT-PCR分析,VPA聯(lián)合不同濃度As2O3組與單用A

12、s2O3組比較Survivin mRNA表達均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　9.2經(jīng)Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn),VPA聯(lián)合不同濃度As2O3組與單用As2O3組比較Survivin蛋白表達均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1. VPA增加As2O3誘導(dǎo)NB4細胞株存活率下降
　　2.小劑量As2O3誘導(dǎo)血管新生相關(guān)因子VEGF/Flt-1及MMP-9表達增加