1、腰椎退行性變是常見(jiàn)病和多發(fā)病，其病因復(fù)雜。目前眾多的研究認(rèn)為椎間盤(pán)退變與終板下微循環(huán)障礙密切相關(guān)。終板下微循環(huán)障礙引起的局部缺血性改變，影響了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)透過(guò)終板對(duì)椎間盤(pán)的供應(yīng)，最終導(dǎo)致椎間盤(pán)退變。如能在終板下椎體的缺血階段進(jìn)行及時(shí)治療，改善局部微循環(huán)，便有可能預(yù)防或延緩椎間盤(pán)退變的發(fā)生。因此研究如何改善終板下微循環(huán)從病因上防治椎間盤(pán)退變有重要的臨床意義。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPC)是血

2、管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)的前體細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖和分化能力，在缺血區(qū)域歸巢后能形成新生的血管。EPC已在心肌及下肢等缺血性疾病的基礎(chǔ)研究和初步臨床應(yīng)用中顯示出重要的治療價(jià)值，有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但目前尚未見(jiàn)EPC用于治療腰椎退性變疾病的研究。
　　 本研究首先采用經(jīng)皮穿刺兔腰椎終板下椎體注射平陽(yáng)霉素的方法破壞終板下微循環(huán)，造成終板下缺血?jiǎng)游锬Ｐ停^察椎間盤(pán)退變過(guò)程。MRI及病理驗(yàn)證顯示動(dòng)物模型穩(wěn)

3、定、可靠；通過(guò)兔腰動(dòng)脈數(shù)字減影血管造影(DSA)和血管鑄型的對(duì)照研究，分析兔腰椎椎體及椎間盤(pán)血供的來(lái)源，可為今后經(jīng)腰動(dòng)脈選擇性插管給藥或細(xì)胞治療提供指導(dǎo)。將終板下缺血?jiǎng)游锬Ｐ凸撬鑱?lái)源的EPC,在體外CM-DiI熒光標(biāo)記后自體移植，分為腰動(dòng)脈和耳緣靜脈兩種移植途徑，術(shù)后觀察EPC在終板下缺血椎體的歸巢、分化和血管生成情況，比較兩種移植途徑對(duì)防治椎間盤(pán)退變的療效差異。初步探討EPC移植治療終板下椎體缺血防治椎間盤(pán)退變的可行性。本研究分為三個(gè)

4、部分：
　　 第一章：兔腰椎終板下缺血模型的制作及腰動(dòng)脈造影與血管鑄型研究。
　　 目的：評(píng)價(jià)經(jīng)皮穿刺兔腰椎終板下椎體，注射平陽(yáng)霉素制作椎體終板下缺血模型的可行性；通過(guò)兔腰動(dòng)脈血管鑄型與造影的對(duì)照研究，探討椎體及椎間盤(pán)的血供來(lái)源。
　　 方法：選取42只新西蘭大白兔，每兔設(shè)第5腰椎(L5)為實(shí)驗(yàn)組、第4腰椎(L4)為自身對(duì)照組。穿刺腰椎終板下椎體，L5注射平陽(yáng)霉素(2 mg/mL)1 mL，L4注射生理鹽水1 m

5、L。術(shù)后第1、2、3、4、5周、2月及3月隨機(jī)選取6只行MRI檢查，并取病理送檢。測(cè)量對(duì)比第4周實(shí)驗(yàn)組MRI與病理切片的缺血面積。另選6只兔行腰動(dòng)脈造影和血管鑄型，測(cè)量腰動(dòng)脈及其分支的長(zhǎng)度和直徑。
　　 結(jié)果：對(duì)照組MRI和病理學(xué)檢查均無(wú)特異性變化，實(shí)驗(yàn)組MRI和病理第1～2周變化不明顯，第3周出現(xiàn)FST1WI低信號(hào)，T2WI及FST2WI呈稍高信號(hào)，第4周信號(hào)變化更明顯；第3～4周病理骨小梁排列雜亂，骨細(xì)胞逐漸減少，椎體骨髓內(nèi)

6、血細(xì)胞減少，脂肪細(xì)胞增多融合，終板軟骨細(xì)胞減少、結(jié)構(gòu)紊亂，纖維環(huán)及髓核無(wú)明顯變化；第5周出現(xiàn)椎間盤(pán)退變表現(xiàn)，第2、3月終板下椎體缺血持續(xù)存在、椎間盤(pán)退變更加明顯。實(shí)驗(yàn)組第4周MRI與病理切片缺血面積之間有顯著正相關(guān)性(r=0.965,P＜0.001)。腰動(dòng)脈DSA與血管鑄型可以清楚顯示腰動(dòng)脈的達(dá)3級(jí)分支水平，兩者對(duì)比研究顯示測(cè)量結(jié)果具有一致性(t檢驗(yàn)，P＞0.05)。
　　 結(jié)論采用經(jīng)皮穿刺終板下椎體注射平陽(yáng)霉素的方法可成功制作

7、兔腰椎終板下缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，具有?chuàng)傷小、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好和成功率高的特點(diǎn)。該模型是研究腰椎及椎間盤(pán)退變較理想的一種動(dòng)物模型。腰動(dòng)脈DSA與血管鑄型研究顯示，腰動(dòng)脈支干內(nèi)側(cè)支是兔腰椎體及椎間盤(pán)的血供來(lái)源，這可以指導(dǎo)經(jīng)腰動(dòng)脈途徑細(xì)胞治療或插管給藥。
　　 第二章：兔骨髓來(lái)源血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定。
　　 目的：建立新西蘭大白兔骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與鑒定的方法，并探討其生物學(xué)特性

8、，為EPC移植防治椎間盤(pán)退變提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：穿刺收集終板下椎體缺血模型兔的股骨及脛骨骨髓24例，單核細(xì)胞采用密度梯度離心法分離，接種在纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)。以EGM-2培養(yǎng)基誘導(dǎo)擴(kuò)增EPC。EPC的鑒定：DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I熒光雙標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)；EPC向血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)分化的能力采用透射電鏡和管腔形成實(shí)驗(yàn)予以鑒定。
　　 結(jié)果：分離的EPC培養(yǎng)72小時(shí)可見(jiàn)貼壁細(xì)胞形

9、成明顯克隆集落，培養(yǎng)7天見(jiàn)克隆集落數(shù)目增加，9天的細(xì)胞融合度約達(dá)85％，第13天時(shí)見(jiàn)細(xì)胞排列呈鋪路石樣。培養(yǎng)至第7天細(xì)胞Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I雙熒光染色陽(yáng)性率為(86.4±4.0)％，CD133、CD34及KDR標(biāo)記陽(yáng)性率分別為(20.3±3.2)％、(48.3±5.2)％及(62.4±4.2)％。第14天CD133、CD34及KDR標(biāo)記陽(yáng)性率分別為(3.6±3.8)％、(35.6±2.4)％及(86.5±6.3)％

10、，CD133、CD34及KDR陽(yáng)性率的前后比較，有顯著意義(t檢驗(yàn)，P＜0.05)。培養(yǎng)第10天的EPC透射電鏡檢查顯示成熟血管EC特征性結(jié)構(gòu)-Weibel-Palade小體。EPC的管腔形成實(shí)驗(yàn)表明，體外培養(yǎng)7天至12天的EPC具有較強(qiáng)的管腔形成能力。
　　 結(jié)論：采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)的兔骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下可分化為EPC，純度較高，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。體外培養(yǎng)7天至12天的EPC具有良好的管

11、腔形成能力。
　　 第三章：經(jīng)不同途徑移植CM-DiI標(biāo)記的兔血管內(nèi)皮祖細(xì)胞在腰椎終板下缺血區(qū)的歸巢及療效研究。
　　 目的：經(jīng)兔腰動(dòng)脈和耳緣靜脈途徑自體移植CM-DiI標(biāo)記的EPC，探討EPC在兔在終板下椎體缺血的歸巢情況與治療效果。
　　 方法：分次抽取48只模型兔的骨髓并分離出EPC，培養(yǎng)至7天的貼壁細(xì)胞以CM-DiI熒光標(biāo)記計(jì)數(shù)。48只抽髓兔隨機(jī)分為經(jīng)腰動(dòng)脈移植組(A組，n=24)和經(jīng)耳緣靜脈移植組(B組

12、，n=24)，未抽髓模型兔設(shè)為空白對(duì)照組(C組，n=18)。每兔自體移植的EPC數(shù)量4×106。A、B組術(shù)后7天，1月熒光顯微鏡下觀察EPC在終板下缺血區(qū)的歸巢與血管生成情況，術(shù)后1、2及3月行腰椎MRI檢查，測(cè)量三組終板下椎體缺血區(qū)的血管計(jì)數(shù)變化并做統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。
　　 結(jié)果：A組術(shù)后7天見(jiàn)呈紅色熒光標(biāo)記的EPC在終板下椎體缺血區(qū)歸巢、1月可見(jiàn)局部血管形成；1月至3月缺血區(qū)血管計(jì)數(shù)增多，MRI示EPC移植后缺血區(qū)信號(hào)逐漸恢復(fù)正常

13、，椎間盤(pán)未見(jiàn)退變表現(xiàn)；B、C組則未見(jiàn)EPC歸巢，血管計(jì)數(shù)逐漸減少，MRI示終板下椎體缺血信號(hào)逐漸明顯，對(duì)應(yīng)椎間盤(pán)逐漸退變。EPC移植1、2及3月三組的血管計(jì)數(shù)的單因素ANOVA：A組1、2、3月組內(nèi)比較，F(xiàn)=34.887，不同時(shí)間點(diǎn)的三組間比較：1月F=40.724，2月F=157.343，3月F=267.234，均P＜0.05(單因素ANOVA)。以上結(jié)果進(jìn)一步以LSD法行兩兩多重比較的結(jié)果：A組的1月與2月、1月與3月、2月與3月比