1、1.研究目的:盡管已經(jīng)有研究結果顯示IVF子代會出現(xiàn)血管代謝紊亂、全身性和肺循環(huán)功能紊亂以及心血管結構的重塑，但是這方面的機制尚且缺乏研究。我們的課題首先針對中國3-13歲的IVF子代及其條件吻合的對照組子代進行了大樣本的血壓監(jiān)測;然后借助臍靜脈來模擬子代血管，試圖從蛋白水平上發(fā)現(xiàn)差異功能蛋白;關于IVF子代后期生長發(fā)育中發(fā)生紊亂的原因，目前說法不一，有人認為是IVF技術本身導致，有人認為是不孕因素導致，而我們的研究最后試圖通過臨床和基

2、礎研究相結合的方式來發(fā)現(xiàn)這些蛋白差異表達的原因，從而挖掘出IVF子代血管功能紊亂的機制。
　　2.材料和方法:
　　(1)對在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院借助IVF技術和自然妊娠出生的3-13歲的子代進行隨訪，以新鮮胚胎移植出生的單胎為實驗組，以同期相應的自然妊娠出生的單胎作為對照組，對其身高、體重、BMI、收縮壓、舒張壓和心率進行統(tǒng)計分析。所選的IVF均為管性不孕，另外兩組均排除子代出生時血管功能缺陷、家族型血管疾病、妊娠

3、高血壓和妊娠高血糖。
　　(2)從浙江大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院分別收集IVF組和對照組臍血管14例以及45例IVF組和48例對照組臍血。入選標準為:產(chǎn)婦的年齡為25-35歲，孕周足月，單胎妊娠、出生體重為大于2500g小于4000g，剖腹產(chǎn)，并且排除各種妊娠并發(fā)癥和子代出生缺陷。其中3例IVF組和3例對照組的臍靜脈用來提取蛋白用于蛋白組學實驗。其余用于后面的驗證實驗(熒光定量PCR和western blotting)和免疫組化實驗。利用

4、碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒測量了臍血中的雌激素濃度。
　　(3)體外實驗以人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)為研究對象，通過不同濃度的雌激素處理，采用熒光定量PCR技術和western blotting技術檢測lumican和vimentin的表達水平。
　　(4)利用小RNA干擾技術將HUVECs的vimentin干擾后，利用免疫熒光、流式細胞術和transwell方法分別檢測細胞的形態(tài)、細胞周期和細胞的遷移能力

5、。
　　3.實驗結果:
　　(1)大規(guī)模流行病學調(diào)查結果顯示在3-6歲和6-13歲組中，IVF組的收縮壓和舒張壓均顯著性高于對照組。
　　(2)應用iTRAQ檢測2組臍血管差異蛋白的表達，我們總共鑒定到723個蛋白，其中上調(diào)蛋白335個，下調(diào)蛋白388個。借助特征分析(Correlation-based FeatureSelection)技術，根據(jù)變化倍率至少為+/-1.2倍，最終篩選到了47個差異蛋白，其中20個上調(diào)

6、，27個下調(diào)。對這47個差異蛋白進行IPA生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與血管系統(tǒng)發(fā)育和代謝功能相關。
　　(3)從蛋白組學結果中篩選了一個上調(diào)蛋白lumican和下調(diào)蛋白vimentin進行驗證。熒光定量PCR和western blotting結果與蛋白組學結果是一致的。
　　(4) IVF組的臍血雌激素濃度是顯著高于對照組的。說明IVF子代在胚胎發(fā)育過程中受到了高雌激素的刺激，因此高雌激素有可能是引發(fā)這些蛋白差異表達的重

7、要原因。
　　(5)不同濃度的雌激素處理HUVECs后發(fā)現(xiàn)，高濃度的雌激素會上調(diào)lumican的表達，卻抑制vimentin的表達。這一結果和蛋白組學的結果是吻合的。說明我們前面的假設“雌激素是引發(fā)IVF子代臍血管蛋白差異表達的重要因素”是正確的。
　　(6)把HUVECs中的vimentin干擾后，細胞的形態(tài)發(fā)生了皺縮，細胞周期最阻滯于S期，細胞的遷移能力也受到了抑制，說明該蛋白的表達下調(diào)會影響到血管內(nèi)皮行使正常的生理功能