1、目的：本實(shí)驗(yàn)在運(yùn)用組織塊重復(fù)貼壁培養(yǎng)原代平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上,復(fù)制人臍靜脈平滑肌細(xì)胞(humanumbilicalveinsmoothmusclecells,HUSMCs)鈣化模型,探尋外源性硫化氫(hydrogensulfide,H2S)供體硫氫化鈉(sodiumhydrosulfide,NaHS)對HUSMCs鈣化干預(yù)機(jī)制研究。
　　方法：
　　1.原代人臍靜脈組織塊重復(fù)貼壁培養(yǎng)法
　　以改良人臍靜脈平滑肌細(xì)胞貼壁培

2、養(yǎng)法為基礎(chǔ),將已培養(yǎng)組織塊再次接種于新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長,采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定為平滑肌細(xì)胞。
　　2.H2S對HUSMCs鈣化干預(yù)及其機(jī)制研究
　　2.1在成功復(fù)制HUSMCs鈣化模型基礎(chǔ)上,給予NaHS進(jìn)行培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分為6組(n=6):對照組(10％FBS正常培養(yǎng)液)、鈣化組(12mmol/Lβ-GP)、單純NaHS組(8.0×10-6MNaHS)、鈣化+NaHS高劑量組(4.0×10-5MN

3、aHS)、鈣化+NaHS中劑量組(8.0×10-6MNaHS)、鈣化+NaHS低劑量組(1.6×10-6MNaHS)。
　　2.2檢測方法
　?、賹?xì)胞VonKossa染色、顯微圖像分析、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性和細(xì)胞鈣含量等指標(biāo)進(jìn)行檢測,觀察各組細(xì)胞鈣沉積情況。
　?、诿嘎?lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ

4、1)的活性。
　?、跼eal-TimePCR法檢測細(xì)胞中TGFβ1mRNA及核心結(jié)合因子α1(corebindingfactorα1,Cbfα1)mRNA表達(dá)。
　?、躓esternblot法檢測HUSMCs中骨橋蛋白(osteopontin,OPN)表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　H2S對HUSMCs鈣化的影響及其機(jī)制研究
　?、貶2S可明顯減少HUSMCs鈣結(jié)節(jié)的聚集生長,VonKossa染色顯示細(xì)胞聚集處棕褐

5、色鈣結(jié)節(jié)較鈣化組明顯減輕(P<0.05);NaHS-低、中、高劑量組鈣化細(xì)胞百分比、細(xì)胞鈣含量和堿性磷酸酶活性較鈣化組明顯降低(P<0.05)。
　?、贜aHS-低、中、高劑量組與鈣化組相比,培養(yǎng)液中TGFβ1的活性、細(xì)胞內(nèi)TGFβ1mRNA、Cbfα1mRNA表達(dá)及OPN表達(dá)均較鈣化組減少(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　H2S可能通過影響TGFβ1-Smads-Cbfα1信號通路級聯(lián)效應(yīng),減弱信號通路中關(guān)鍵信號分