1、研究背景:
　　炎癥性?。↖nflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，是一種新興的全球性的疾病，其確切發(fā)病機(jī)制不明。最近研究顯示，腸道屏障的破壞與UC和CD有關(guān)。同時(shí)，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群涉及腸道炎癥的病理生理過程。細(xì)菌鞭毛蛋白(flagellin)是細(xì)菌鞭毛的主要組成成分，也是細(xì)菌重要毒性成分

2、，現(xiàn)有關(guān)鞭毛蛋白與腸道屏障關(guān)系的研究較少。
　　目的:
　　在Transwell細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)T84細(xì)胞單層(T84 monolayer)模擬腸上皮屏障，通過對(duì)細(xì)菌鞭毛蛋白處理前后極化T84細(xì)胞單層的跨上皮電阻(Transepithelial electric resistance，TER)及對(duì)大分子物質(zhì)辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)流量的檢測，研究細(xì)菌鞭毛蛋白對(duì)T84細(xì)胞單層

3、通透性的影響，進(jìn)而探討鞭毛蛋白與腸道屏障關(guān)系。
　　方法:
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用T84細(xì)胞單層。為了評(píng)估T84細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)鞭毛蛋白及鞭毛蛋白對(duì)T84細(xì)胞單層通透性的影響，我們將細(xì)菌鞭毛蛋白及HRP加入到細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側(cè)中。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immune assay,ELISA)的方法檢測基底側(cè)樣本中的鞭毛蛋白、HRP。HRP流量及T84細(xì)胞單層TER作為評(píng)價(jià)T84細(xì)胞單層的通透性指標(biāo)。人肥

4、大細(xì)胞系(Human mast cell line，HMC-1)來源于人肥大細(xì)胞白血病細(xì)胞，激活后具有肥大細(xì)胞特性，與T84細(xì)胞共培養(yǎng)于細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中。
　　2.不同濃度細(xì)菌鞭毛蛋白加入細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側(cè)與T84細(xì)胞共同孵育。2小時(shí)后測量TER及HRP流量來評(píng)價(jià)細(xì)菌鞭毛蛋白對(duì)腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞單層的屏障功能的影響。
　　3.細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)隨機(jī)分為正常對(duì)照組、鞭毛蛋白組、HMC-1組、鞭毛蛋白+HMC-1組及酮替芬干

5、預(yù)組并給予相應(yīng)處理。共培養(yǎng)2小時(shí)后，測量各組TER及HRP流量。收集正常對(duì)照組、HMC-1組、鞭毛蛋白+HMC-1組和酮替芬干預(yù)組基底側(cè)細(xì)胞上清液用ELISA方法檢測組胺及類胰蛋白酶β2(Mast cell tryptase，MCT)，從而評(píng)價(jià)不同處理組對(duì)腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞單層的屏障功能的影響。
　　4.為了觀察T84細(xì)胞攝取鞭毛蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)T84細(xì)胞，把細(xì)菌鞭毛蛋白按不同劑量加入到細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，37℃孵育。2小時(shí)

6、后收集細(xì)胞培養(yǎng)板中T84細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測胞漿內(nèi)鞭毛蛋白。為了觀察T84細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)鞭毛蛋白，將T84細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)中，在腸腔側(cè)中加入鞭毛蛋白，2h后收集基底側(cè)中培養(yǎng)基，用ELISA方法檢測鞭毛蛋白。
　　5.所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)方法進(jìn)行正態(tài)性分析，Levene檢驗(yàn)方法進(jìn)行方差齊性分析，多組數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析(On

7、e-wayANOVA)，對(duì)多組數(shù)據(jù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的再進(jìn)行兩兩比較(LSD-t檢驗(yàn))。兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman秩相關(guān)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度鞭毛蛋白加入跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側(cè)，其相對(duì)TER(comparative TER)變化為:當(dāng)鞭毛蛋白濃度小于8mg/L時(shí)，增加腸腔側(cè)鞭毛蛋白濃度，不引起上皮細(xì)胞跨膜電阻的下降。但當(dāng)

8、鞭毛蛋白濃度大于8mg/L時(shí)，隨著鞭毛蛋白濃度增加，跨膜電阻逐漸下降，與正常對(duì)照組及小濃度鞭毛蛋白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2536.68，P＜0.05)。不同濃度鞭毛蛋白加入跨膜培養(yǎng)系統(tǒng)腸腔側(cè)，HRP流量變化如下:當(dāng)鞭毛蛋白濃度小于8mg/L時(shí)，增加腸腔側(cè)鞭毛蛋白濃度，不引起HRP流量的增加。但當(dāng)鞭毛蛋白濃度大于8mg/L時(shí)，隨著鞭毛蛋白濃度增加，HRP流量逐漸增加，與正常對(duì)照組及小濃度鞭毛蛋白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=872

9、.05，P＜0.05)。
　　2.各組處理對(duì)腸上皮細(xì)胞系T84細(xì)胞單層的屏障功能影響結(jié)果比較:①正常對(duì)照組與HMC-1組TER和HRP流量較處理前無明顯變化，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②鞭毛蛋白組comparativeTER值為（59.73±7.00）％較正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。同時(shí)鞭毛蛋白組的T84細(xì)胞單層HRP流量結(jié)果（0.08±0.01）％與正常對(duì)照組相比較有明顯差異(P＜0.05)。⑧鞭毛蛋白+

10、HMC-1組comparative TER值為（39.35±0.81）％，較鞭毛蛋白組降低(P＜0.05)。同時(shí)鞭毛蛋白+HMC-1組的T84細(xì)胞單層HRP流量結(jié)果（0.27±0.03）％與鞭毛蛋白組相比有明顯差異(P＜0.05)。④酮替芬干預(yù)組comparative TER值為(45.25±3.64)％，較鞭毛蛋白+HMC-1組明顯升高(P＜0.05)。同時(shí)酮替芬干預(yù)組的T84細(xì)胞單層HRP流量結(jié)果(0.19±0.04)％與鞭毛蛋白+

11、HMC-1組相比有明顯差異(P＜0.05)。
　　3.光學(xué)顯微鏡下觀察免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:鞭毛蛋白孵育過的T84細(xì)胞（鞭毛蛋白組）細(xì)胞質(zhì)被染成棕褐色，而正常生長T84細(xì)胞(陰性對(duì)照組）細(xì)胞質(zhì)為淡藍(lán)色。結(jié)果提示:鞭毛蛋白被T84細(xì)胞攝取至細(xì)胞質(zhì)中。用ELISA方法檢測基底側(cè)鞭毛蛋白結(jié)果顯示:鞭毛蛋白組基底側(cè)鞭毛蛋白OD值明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且OD值均值大于1.5倍正常對(duì)照組OD值，即在基底側(cè)能檢測到鞭

12、毛蛋白。
　　4.對(duì)正常對(duì)照組、HMC-1組、鞭毛蛋白+HMC-1組、酮替芬干預(yù)組進(jìn)行組胺及MCT檢測，發(fā)現(xiàn)各組組胺濃度及MCT水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后經(jīng)組間兩兩比較，結(jié)果提示:無鞭毛蛋白刺激下，HMC-1不分泌或少量分泌組胺和MCT，在鞭毛蛋白刺激下，HMC-1分泌組胺及MCT增加。而酮替芬能抑制肥大細(xì)胞組胺及MCT的釋放。
　　5.HRP流量與組胺濃度、MCT水平的相關(guān)性分析結(jié)果:組胺濃度與HRP流量之間r=0.86，P