1、1、研究背景：
　　 人類的疾病，尤其是各種癌癥，總是與環(huán)境因素有著不可分割的聯(lián)系。我們周圍的環(huán)境日益復雜，伴隨著的是大量的食品添加劑、農藥、家用化學品等等。這些物質通過各種途徑危害著人們的健康，例如通過改變人類細胞的生物途徑而導致細胞的惡性轉化，最終導致癌細胞的形成。環(huán)境污染物增多的結果就是每年各種不同癌癥病例的不斷增加。因此，對于這些化學物質是通過怎樣的機理以及復雜的途徑導致各種癌癥的形成，引起了世界各地許多科研工作者的高度

2、關注。雖然目前有許多關于化學物質暴露水平與致癌相關的探索性研究獲得了重要成果，但是人們對于致癌的分子機制以及成因仍然不是很清楚。更關鍵的是，如何將這些環(huán)境污染物致癌的毒理學機制和成因與最終預防癌癥的發(fā)生聯(lián)系起來。
　　 在后基因時代，表觀遺傳學在生命科學領域中普遍受到關注。表觀遺傳是指沒有DNA序列變化的、可通過有絲分裂和減數分裂在細胞和世代間傳遞的基因表達改變。表觀遺傳學研究主要涉及DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質重塑以

3、及MicroRNA、SiRNA等。也就是說，與遺傳學不同，各種表觀遺傳現象不會涉及基因雜合、基因突變或者微衛(wèi)星不穩(wěn)等等，但是也能在細胞分裂生長時與基因序列一樣傳給分裂細胞。雖然沒有導致基因序列的變化，但是這些表觀遺傳現象，如DNA甲基化的變化卻會引起基因的表達發(fā)生變化。這也就可以解釋，在一個多細胞的組織或器官中，為什么擁有相同基因序列的細胞會根據需要發(fā)展成為具有完全不同功能的細胞。表觀遺傳修飾，例如DNA甲基化以及組蛋白修飾，與染色質重

4、組復合蛋白一起決定了染色質結構的凝聚狀態(tài)和基因的轉錄活性。
　　 癌癥是一種與基因變異和表觀遺傳變異都相關的疾病。多數人對于癌癥的理解為，這是一種由于基因變異導致體細胞失去正常調控而引起的疾病。這種變異包括堿基替代、插入和切除，以及由于DNA鏈的斷裂造成的序列重組等等。而目前越來越多的研究發(fā)現，在有絲分裂過程中，伴隨著DNA復制一同穩(wěn)定繼承下來的表觀遺傳修飾也是引起癌癥的一個因素，例如胞嘧啶甲基化的改變。目前被證實的與表觀遺傳調

5、控基因而導致腫瘤生成的包括了肺癌、前列腺癌以及乳腺癌等等。盡管表觀遺傳修飾在生命早期就已經確定下來了，但是隨著內源的或周圍環(huán)境的刺激，其發(fā)生的改變可以是伴隨一生的。通過表觀遺傳這樣一種途徑，外在環(huán)境刺激就影響到了基因的表達和染色質結構。因此，表觀遺傳修飾的改變有可能是環(huán)境污染物質誘導腫瘤生成的一個關鍵因素。
　　 六價鉻(Cr(Ⅵ))是工業(yè)上常用的一種材料，在電子產品中就有廣泛的用途，如用于色素中的著色劑及冷卻水循環(huán)系統(tǒng)中，如吸

6、熱幫浦、工業(yè)用冷凍庫及冰箱熱交換器中的防腐蝕劑。但是其毒性很強，可能導致敏感以及造成遺傳性基因缺陷。長期或短期接觸以及吸入時將會有致癌危險，對環(huán)境也有持久性危險。對鉻類產品的研究也發(fā)現鉻暴露容易引起與呼吸相關的癌癥，如肺癌。苯并芘(benzo(a)pyrene，B[a]P)也是一種強致癌物，可引起肺癌、胃癌、皮膚癌等，屬于多環(huán)芳烴類化合物(PAH)，廣泛存在于煤焦油、煙草燃燒生成的煙霧、油炸食物以及汽車尾氣中。國際癌癥研究機構將其列為第

7、二類A組人類致癌物質。
　　 聯(lián)合毒性是環(huán)境毒理學的一個重要研究方向，即指兩種或兩種以上毒物共同作用于目標時其保留或改變各自毒性作用的現象。由于自然環(huán)境的復雜性，有毒化合物不可能單獨存在，更多的是兩種或多種化合物共存，它們作用于生物體時往往會因為污染物之間發(fā)生交互作用，產生協(xié)同或者拮抗以及加合的效應而表現出與單一作用完全不同的聯(lián)合毒性來。單個污染物的研究雖然具有一定的參考價值，但作為制定環(huán)境標準以及環(huán)境容量的依據，就顯得證據不足

8、，因此混合化合物對機體的聯(lián)合作用越來越受到人們的重視。而且，由于污染多有伴生性和綜合性的特點，研究幾種環(huán)境污染物的聯(lián)合損傷效應更加接近環(huán)境真實性，國際上對于這種聯(lián)合毒性的研究也多有報道。Cr(Ⅵ)和B[a]P都是廣泛存在于環(huán)境中的污染物。目前國際上已經開始關注兩者的聯(lián)合毒性效應，因為現代社會同時受到多環(huán)芳烴化合物和重金屬污染的情況已經非常普遍了，而Cr(Ⅵ)和B[a]P分別是這兩類物質的代表。
　　 本研究為了解Cr(Ⅵ)和B[

9、a]P對于支氣管上皮細胞的聯(lián)合毒性效應，包括遺傳毒性和表觀遺傳修飾變化，分析這兩種環(huán)境污染物的聯(lián)合毒性效應，并探討表觀遺傳效應在聯(lián)合毒性中所起的作用，為Cr(Ⅵ)和B[a]P的環(huán)境衛(wèi)生標準以及容許濃度提供實驗基礎，也為化學致癌的防治提供新的思路。
　　 2、研究方法：
　　 2.116HBE細胞的生物學特征研究、細胞毒性及氧化損傷的檢測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細胞6h、12h以及24h

10、，采用CCK-8測定終點，根據測定結果確定染毒劑量和染毒時間，最終設置溶劑對照組(Ctrl)、Cr(Ⅵ)處理組(0.3μM、0.6μM、1.2μM、2.5μM和5μM)、B[a]P處理組(2.5μM、5μM、10μM、20μM和40μM)和聯(lián)合毒物處理組(B[a]P-Cr(Ⅵ):1.2-0.1μM、2.5-0.3μM、5-0.6μM、10-1.2μM和20-2.5μM)共3組15個劑量。比較正常細胞和染毒細胞的形態(tài)學差異;用單細胞凝膠電

11、泳實驗檢測各組細胞的DNA損傷程度;用熒光定量PCR(Q-PCR)對氧化損傷修復基因(OGG1、MGMT、MYH、MTH1)和堿基修復基因(XRCC1、MLH1、MSH6、PARP-1)進行檢測。
　　 2.216HBE細胞的凋亡和周期變化的檢測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細胞24h，采用流式細胞儀或單細胞凝膠電泳實驗檢測細胞的凋亡情況和周期變化情況，用熒光定量PCR(Q-PCR)對凋亡相關基因(

12、Caspase3、bax、Bcl-2)進行檢測。
　　 2.3整體基因組DNA甲基化的檢測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細胞24h，采用5-甲基胞嘧啶抗體免疫熒光法和亞硫酸氫鹽修飾法檢測16HBE細胞整體基因組DNA甲基化的變化趨勢，并用western blot法檢測DNA甲基轉移酶和甲基化結合蛋白在細胞中的含量變化。
　　 2.4組蛋白乙?；降臋z測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[

13、a]P以及兩者聯(lián)合處理細胞24h，采用細胞免疫熒光法以及western blot法檢測各處理組細胞的組蛋白H3和H4整體乙?；剑⒂脀estern blot法檢測組蛋白去乙?；冈诩毎械暮孔兓?。
　　 2.5組蛋白生物素化水平的檢測
　　 分別用Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細胞24h，采用Western blot法檢測各處理組細胞的組蛋白生物素化水平，以Q-PCR法和Western blot法檢測組蛋白

14、生物素化相關蛋白在不同處理組中的表達變化和在細胞中的含量變化，并用細胞免疫熒光法對組蛋白生物素化相關蛋白在細胞中的位置進行觀察。
　　 3、研究結果：
　　 3.116HBE細胞的生物學特征研究、細胞毒性及氧化損傷的檢測用不同濃度的Cr(Ⅵ)、B[a]P以及兩者聯(lián)合處理細胞后發(fā)現細胞的存活率呈劑量依賴性降低，且時間越長，細胞存活率越低。通過形態(tài)學觀察，發(fā)現正常細胞形態(tài)完整，呈長形，胞質較多，排列較為疏松;而染毒后細胞呈方

15、形，胞質減少，排列非常緊密。
　　 無論是Cr(Ⅵ)、B[a]P還是兩者聯(lián)合處理細胞，各項損傷指標（尾部DNA％、尾長、尾矩、OTM值）均呈劑量依賴性增高，且隨著染毒濃度的提高，根據尾矩對細胞損傷程度分級，高等級損傷的細胞所占比例越來越大。具體而言，B[a]P導致的細胞綜合損傷程度最高，Cr(Ⅵ)染毒對細胞損傷程度最小，但是最高劑量組中重度損傷細胞所占比例大于其他兩類染毒方式;聯(lián)合染毒對細胞的綜合損傷程度類似于Cr(Ⅵ)，但是在

16、低劑量時就出現重度損傷細胞，早于其他兩類染毒方式。
　　 Cr(Ⅵ)促進MUTYH和MTH1的表達，抑制MGMT的表達，對OGG1的影響不明顯;B[a]P對OGG1、MUTYH和MTH1都有促進表達的作用，同樣抑制MGMT的表達;聯(lián)合染毒的效果偏向于Cr(Ⅵ)染毒，促進MUTYH和MTH1的表達，抑制MGMT的表達，對OGG1的影響不明顯。
　　 Cr(Ⅵ)對堿基修復基因的表達影響不大，高劑量染毒才能導致PARP-1、M

17、LH1和MSH6的表達顯著提高，而對PARG和XRCC1的表達幾乎無影響;B[a]P對該類基因的表達影響非常明顯，最低劑量就可以導致4個基因表達的升高;聯(lián)合染毒的效果類似于B[a]P，促進4個基因的表達，對XRCC1、MLH1和MSH6的影響都具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05）。
　　 3.216HBE細胞的凋亡和周期變化的檢測
　　 凋亡檢測結果顯示，3類染毒方式對細胞凋亡的影響都相似，與溶劑對照組相比較，低劑量的毒物都能

18、夠引起較高比例的凋亡細胞產生;隨著染毒劑量的增加，凋亡細胞的比例逐漸降低。周期檢測結果顯示，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，細胞的G1期和G2期逐漸縮短，而S期逐漸加長;B[a]P染毒對細胞周期影響非常明顯，最低劑量組(2.5μM)就能夠明顯縮短G1期和G2期，延長S期，隨著B[a]P劑量的增加G1期有所延長，而S期有所降低。
　　 Cr(Ⅵ)可以促進Caspase3和bax的表達，抑制Bcl-2的表達;而B[a]P同樣促進Caspa

19、se3和bax的表達，但是對Bcl-2的影響不大;聯(lián)合染毒的效果類似于B[a]P，對Caspase3和bax有促進作用，而對Bcl-2無明顯影響。
　　 3.3整體基因組DNA甲基化的檢測
　　 低劑量Cr(Ⅵ)染毒可以明顯降低細胞的整體甲基化程度，隨著Cr(Ⅵ)濃度的增加，細胞整體甲基化程度逐漸回升，而最高劑量組（5μM）的整體甲基化程度較溶劑對照組有顯著性提高;B[a]P可以導致細胞整體甲基化程度的降低，隨著B[a]

20、P濃度的增加，整體甲基化程度逐漸降低，具有劑量效應關系;低劑量的聯(lián)合毒物降低了細胞整體甲基化水平，隨著染毒劑量增加，整體甲基化程度逐步回升，在染毒劑量為5-1.2μM時達到最高，然后再次降低。
　　 Cr(Ⅵ)染毒對Dnmt1的影響不明顯，增加了Dnmt3b在細胞中的含量，且具有劑量效應關系，而在最高劑量時才使MBD2的含量有明顯增加;B[a]P染毒明顯增加了Dnmt1和MBD2在細胞中的含量，而隨著B[a]P濃度的增加，Dnm

21、t3b的含量逐漸減少，具有劑量效應關系;聯(lián)合染毒降低了Dnmt1和MBD2在細胞中的含量，而增加了Dnmt3b的含量。
　　 3.4組蛋白乙?；降臋z測
　　 隨著Cr(Ⅵ)染毒劑量的提高，H3和H4乙酰化水平逐漸降低。用Western blot法對組蛋白乙?；嚓P蛋白進行檢測后發(fā)現，Cr(Ⅵ)對HDAC2和HDAC3的影響都不大。
　　 但是對于B[a]P處理過的細胞進行檢測后發(fā)現，雖然HDAC2和HDAC3

22、的含量有劑量依賴性的提高，但是H3和H4的整體乙?；阶兓o明顯規(guī)律，并且H4組蛋白乙?；潭冗€略有提高。
　　 Cr(Ⅵ)和B[a]P聯(lián)合處理細胞后發(fā)現，組蛋白乙酰化的水平整體趨勢是增加的。對相關蛋白的檢測發(fā)現，與溶劑對照組相比較，HDAC2和HDAC3的含量在低劑量時有所提高，然后隨著染毒濃度的繼續(xù)提高而逐漸減少，最高劑量組(20，2.5μM)的含量變化較對照組明顯。
　　 3.5組蛋白生物素化水平的檢測

23、　　 BTD在細胞中的含量變化隨著Cr(Ⅵ)濃度的提高而顯著性降低，但是HCS的含量卻幾乎沒有變化。在正常細胞中BTD蛋白均勻分布在細胞核和細胞質中，隨著BTD含量的降低，細胞質中的BTD越來越少，大多集中到了細胞核中，最后基本上只有在細胞核中才能發(fā)現BTD。而HCS在正常細胞中也幾乎絕大部分存在于細胞核之中，由于在Cr(Ⅵ)處理過程中HCS的含量沒有變化，所以在其他Cr(Ⅵ)處理組中HCS的位置也沒有什么變化，都集中在細胞核中。

24、r>　　 B[a]P染毒后，細胞中HCS蛋白含量幾乎沒有變化，而BTD的含量隨著B[a]P濃度的提高而降低。經B[a]P染毒的細胞其組蛋白生物素化水平是隨著B[a]P濃度的提高而逐漸升高的，到B[a]P濃度為10μM時達到最高，然后開始降低。
　　 Cr(Ⅵ)和B[a]P聯(lián)合處理細胞后發(fā)現，HCS在細胞中的含量隨聯(lián)合毒物濃度的提高而顯著提高，而BTD的含量在降低到一定程度后又開始回升。雖然BTD和HCS在細胞中的含量變化與Cr

25、(Ⅵ)單獨處理時不同，但是組蛋白生物素化的水平變化趨勢卻是類似的。
　　 4、結論：
　　 4.1 Cr(Ⅵ)暴露對細胞的損傷主要是因為其在細胞內發(fā)生一系列還原反應導致過量自由基產生，而其最終產物Cr(Ⅲ)與DNA形成加合物導致的損傷所占比例不大。Cr(Ⅵ)單獨暴露所導致的細胞損傷要弱于B[a]P，但是兩者聯(lián)合處理時Cr(Ⅵ)占據主導地位。
　　 4.2聯(lián)合染毒對細胞凋亡的影響與兩者單獨處理時沒有差別，低劑量時細

26、胞凋亡程度顯著增加，高劑量時凋亡程度降低。經Cr(Ⅵ)和B[a]P染毒后，周期停滯時期主要發(fā)生在S期。聯(lián)合染毒對細胞周期的影響結果也與Cr(Ⅵ)單獨處理時情況一致。
　　 4.3低劑量Cr(Ⅵ)降低了細胞的整體甲基化水平，導致染色質穩(wěn)定性失衡以及基因印跡丟失。高劑量B[a]P可以降低細胞的整體甲基化水平。Cr(Ⅵ)和B[a]P聯(lián)合處理細胞時對DNA甲基化水平的影響沒有顯著性變化。
　　 4.4 Cr(Ⅵ)可以降低細胞組蛋