1、隨著基因組計(jì)劃的完成,以及蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的蓬勃開展,促使RNA組學(xué)研究日趨成熟,人類基因組的非編碼組分非編碼RNA(noncodingRNA,ncRNA)在生命過程中所發(fā)揮的不可忽視的重要作用已經(jīng)逐步的到了廣泛的重視和認(rèn)可。通常,基因組研究集中在對基因組序列中開放讀碼框的注釋和功能劃定,然而在真核細(xì)胞中,僅有一小部分組分是基因組編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息,未知功能的非編碼序列占人類基因組的98％,在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起著極為重要的作用

2、[1]。ncRNA被認(rèn)為,在所有真核細(xì)胞調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[2-5],可能具有參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復(fù)制、染色體配對和染色體凝集等作用[3]。目前研究新獲得的數(shù)據(jù)顯示,有一大類功能性RNA分子或隱藏在蛋白質(zhì)編碼區(qū)之間或位于編碼蛋白質(zhì)區(qū)內(nèi)[6-10],其功能有待進(jìn)一步闡明。
　　 為證實(shí)我們的假說,本次研究采用原位雜交技術(shù)[12]和realtime-PCR[13]檢測結(jié)直腸癌惡性腫瘤組織、腫瘤轉(zhuǎn)移組織和正常組織,以及9種人結(jié)直腸癌細(xì)

3、胞株的MALAT 1表達(dá)情況,分析MALAT 1與結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與腫瘤轉(zhuǎn)移性之間的關(guān)系；利用RNA沉默技術(shù)(RNA interference,RNAi)[14-16]和RNA激活技術(shù)(RNA activation,RNAa)[17-20]研究MALAT 1基因在結(jié)直腸癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用,探討MALAT 1基因表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；最后,利用生物信息學(xué)計(jì)算方法[21-23]和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[24-26],篩查不

4、同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細(xì)胞株的差異表達(dá)蛋白,分析鑒定非編碼RNA基因MALAT 1調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因靶點(diǎn)。
　　 第一部分 MALAT 1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)
　　 通過原位雜交技術(shù),RT-PCR和realtime-PCR技術(shù)分別檢測結(jié)直腸癌組織、轉(zhuǎn)移癌組織和正常組織以及9種人結(jié)直腸癌細(xì)胞株MALAT 1的表達(dá)情況。在細(xì)胞水平:RT-PCR產(chǎn)物電泳圖灰度分析[34]顯示:低轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細(xì)胞組MALAT1平均灰

5、度值低于高轉(zhuǎn)移潛能大腸癌細(xì)胞組,差異顯著(t=-8.514,P<0.001).各細(xì)胞株組間灰度值具有顯著差異(F=106.751,P<0.001)；LSD檢驗(yàn)結(jié)果顯示:與Caco-2細(xì)胞相比,COLO-205、LoVo和SW620細(xì)胞MALAT 1表達(dá)量較高,SW480/M5、HT29和HCT116中等量表達(dá),SW480表達(dá)量較低差異顯著(P<0.05)；LS174 T細(xì)胞株表達(dá)量最低。realtime-PCR檢測結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌高轉(zhuǎn)

6、移潛能細(xì)胞株MALAT 1表達(dá)量高于低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株,差異顯著(t=-7.189,P<0.001),結(jié)直腸癌細(xì)胞間MALAT 1基因表達(dá)差異顯著(F=1045.526P<0.01)；Dunnett T3檢驗(yàn)結(jié)果顯示:與大腸癌低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株LS174 T相比,MALAT 1在COLO 205、LOVO、SW620和SW480/M5表達(dá)量較高(P<0.05)；HT29、SW480和HCT116中表達(dá)量較低；原位雜交結(jié)果顯示:高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞

7、株的陽性評分高于低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞組,差異顯著(x2=8.586,P<0.05),MALAT 1陽性信號定位于結(jié)直腸癌細(xì)胞核,各細(xì)胞組間統(tǒng)計(jì)分析差異顯著(x2=11.913,P=0.036),與LS174 T細(xì)胞相比,高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株SW620和LoVo中MALAT 1表達(dá)量較高,差異顯著(P<0.05)。三種方法檢測結(jié)果較為一致:高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株中,MALAT 1表達(dá)量明顯高于低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株,其中以COLO 205和LoVo細(xì)胞MALA

8、T 1表達(dá)量最高,而SW480和LS174 T表達(dá)量最低。
　　 在組織水平:RT-PCR產(chǎn)物電泳圖灰度分析結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌組織中MALAT 1基因表達(dá)間差異顯著(F=99.784,P<0.001)；其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌和結(jié)直腸癌組織中MALAT 1表達(dá)量高于正常大腸黏膜組織,有顯著差異(P<0.01)；進(jìn)行realtime-PCR反應(yīng)結(jié)果顯示:結(jié)直腸癌組織中MALAT 1基因表達(dá)組間差異顯著(F=182.138,P<0.001)

9、；其中淋巴轉(zhuǎn)移癌中MALAT 1表達(dá)量最高,結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量次高,正常組織表達(dá)量最低,差異顯著(P<0.01)。RT-PCR和realtime-PCR檢測結(jié)果一致:與正常黏膜相比,淋巴轉(zhuǎn)移癌中MALAT1表達(dá)量最高,在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)量較高,提示MALAT 1在大腸癌組織中的表達(dá)量與癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 分析細(xì)胞水平和組織水平MALAT 1表達(dá)量結(jié)果顯示:非編碼RNA基因MALAT 1在轉(zhuǎn)移性較高的大腸癌細(xì)胞及組織中表達(dá)

10、明顯高于無轉(zhuǎn)移性或低轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞和組織,MALAT 1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。
　　 第二部分 MALAT 1的表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　 設(shè)計(jì)并構(gòu)建MALAT 1基因干擾(RNA interference,RNAi)載體和基因激活(RNA activation,RNAa)載體,轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞株。熒光定量PCR檢測MALAT1基因變化情況,觀測MALAT 1基因水平上調(diào)或下調(diào)后結(jié)直腸癌細(xì)胞生物

11、學(xué)行為的相應(yīng)變化。結(jié)果:RNAa載體轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞后,熒光顯微鏡測定轉(zhuǎn)染效率70％左右,realtime-PCR檢測MALAT 1表達(dá)激活效率:與SW620細(xì)胞相比,RNAa處理后細(xì)胞MALAT 1表達(dá)顯著升高(F=177.972,P<0.001),其中SW620-Promoter-dsRNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞上調(diào)2.687±0.114倍、SW620-pro-Cpg-dsRNA載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞上調(diào)3.172±0.118倍,差異顯著(P<0.01

12、)。MTT法觀察MALAT 1表達(dá)上調(diào)后細(xì)胞體外的增殖能力顯著提高(F=1153.007,P<0.001)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:MALAT 1表達(dá)量上調(diào)后細(xì)胞平均克隆形成率升高,差異顯著(F=157.083,P<0.001)。細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測MALAT1基因表達(dá)上調(diào)后細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞穿膜數(shù)明顯高于SW620細(xì)胞組(F=58.286,P<0.001)；RNAi處理后細(xì)胞MALAT 1表達(dá)下調(diào)0.271±0.024倍,差異顯

13、著(F=1701.135,P<0.001)；MALAT 1表達(dá)下調(diào)后,細(xì)胞體外增殖能力下降,差異顯著(F=313.421,P<0.001),細(xì)胞克隆形成率相應(yīng)下降(t=44.472,P<0.001),細(xì)胞體外侵襲能力下降(F=212.160,P<0.001)。
　　 此外,我們還構(gòu)建了MALAT1核心功能序列(MALAT1-functional gene’sfragment,MALAT 1-fgf)表達(dá)載體,以觀察MALAT 1

14、序列是否存在“核心功能區(qū)域”,結(jié)果顯示:載體轉(zhuǎn)染后,MALAT 1/fgf片段表達(dá)上調(diào)(F=200.093,P<0.001),序列其他部分表達(dá)不變(F=1.674,P=0.264)；與SW620細(xì)胞相比,細(xì)胞體外增殖能力無顯著變化(F=892,P=0.452),細(xì)胞克隆形成率無顯著變化(F=0.307,P=0.820),細(xì)胞體外侵襲能力無顯著變化(F=4.257,P=0.071)。提示與RNAa處理后不同,MALAT 1部分序列表達(dá)上調(diào)

15、,對細(xì)胞生物學(xué)行為無影響。
　　 此次試驗(yàn)研究中,成功的完成MALAT 1基因的體外RNA激活表達(dá)試驗(yàn)。設(shè)計(jì)可與MALAT 1啟動(dòng)子樣區(qū)域特異性結(jié)合的dsRNA,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,提取總RNA,熒光定量PCR和原位雜交鑒定,證實(shí)MALAT 1表達(dá)上調(diào),實(shí)現(xiàn)了MALAT 1的基因激活。MALAT 1激活后,細(xì)胞的體外增殖、侵襲能力大大提升。同時(shí),當(dāng)MALAT 1結(jié)構(gòu)不完整時(shí),未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的體外生長、增殖、侵襲能力變化,推測唯有當(dāng)MALAT

16、1結(jié)構(gòu)完整時(shí)才能引起結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生改變。
　　 第三部分 蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合生物信息學(xué)鑒定MALAT-1調(diào)控的靶基因
　　 SW620細(xì)胞和SW620-MALAT 1-dsRNAl細(xì)胞蛋白質(zhì)2D圖譜通過ImageMaster5.0軟件分析和人工確認(rèn),共發(fā)現(xiàn)15個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn),其中6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜成功鑒定。與SW620細(xì)胞相比,SW620-MALAT 1-dsRNAl載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白質(zhì)圖譜中3個(gè)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)

17、,3個(gè)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。
　　 HCT 116細(xì)胞、HCT-MALAT 1/fgf-5235載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和HCT-MALAT1-RNAi載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白質(zhì)譜圖比對,發(fā)現(xiàn)HCT 116細(xì)胞和HCT-MALAT 1/fgf-5235載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白質(zhì)譜圖差異甚微,而HCT-MALAT1-RNAi細(xì)胞蛋白質(zhì)譜圖與二者均有明顯差異,經(jīng)過分析和鑒定,發(fā)現(xiàn)HCT-MALAT 1-RNAi細(xì)胞中存在2個(gè)表達(dá)量明顯下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)根據(jù)蛋白質(zhì)。

18、
　　 通過生物信息學(xué)分析方法得到47個(gè)MALAT 1潛在靶標(biāo)蛋白,篩選得到的差異蛋白絕大部分蛋白都與腫腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移等行為相關(guān),涉及腫瘤細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)、粘附、凋亡等過程,研究結(jié)果為闡明結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及腫瘤早期診斷、尋找預(yù)測結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)在差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)APAK-9,存在于生物信息學(xué)預(yù)測潛在靶標(biāo)范圍中。因此,我們認(rèn)為APAK-9是一種被MALAT-1