1、慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默survivin在口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌基因治療中的實(shí)驗(yàn)研究口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌(oralsquamouscellcarcinoma，OSCC)是最常見口腔腫瘤，導(dǎo)致死亡人數(shù)居口腔疾病之首。應(yīng)用手術(shù)、放療和化療等方法并不能有效提高OSCC患者生存率。特別是化療過程中產(chǎn)生的多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)現(xiàn)象增加了治療難度。因此OSCC發(fā)病機(jī)制及高效治療手段特別是基因治療的研究對患者生存率的提高十

2、分迫切。 由于細(xì)胞周期調(diào)控基因突變或高表達(dá)，腫瘤細(xì)胞周期常出現(xiàn)異常改變。目前細(xì)胞凋亡是腫瘤研究熱點(diǎn)之一。凋亡抑制一方面可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展，另一方面也造成腫瘤細(xì)胞對放、化療耐受。Survivin是凋亡抑制家族成員，表達(dá)于胚胎組織；除弱表達(dá)于胎盤、睪丸、胸腺等組織外，其它終末成熟分化組織均未檢出；與正常組織相反，survivin幾乎在所有人類腫瘤組織不同程度表達(dá)。Survivin不僅可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，而且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞

3、分裂增殖。 研究發(fā)現(xiàn)，survivin也在OSCC表達(dá)。并且我們實(shí)驗(yàn)表明，在非P糖蛋白介導(dǎo)MDR的OSCC細(xì)胞株C-A120中，survivin表達(dá)水平顯著高于敏感前體株KB細(xì)胞。凋亡信號(hào)通路阻斷可導(dǎo)致MDR現(xiàn)象，因此survivin高表達(dá)可能是C-A120細(xì)胞MDR機(jī)制之一。另有研究指出survivin還可促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù)，在腫瘤放療耐受中同樣發(fā)揮重要作用。因此，survivin可能是逆轉(zhuǎn)C-A120細(xì)胞MDR、提高OS

4、CC放、化療敏感性的理想基因治療靶點(diǎn)。 口腔腫瘤的基因治療在臨床試驗(yàn)中仍處于探索階段?；蛑委煹呐R床應(yīng)用及其效果依賴于載體系統(tǒng)的優(yōu)化及轉(zhuǎn)染效率的提高。研究提示以慢病毒為載體的基因沉默具有較好應(yīng)用前景。慢病毒可感染分裂期與非分裂期細(xì)胞，且在靶細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，作為基因載體應(yīng)用了近10年，但在腫瘤基因治療中的研究未充分開展。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建慢病毒RNA干擾(RNAinterference，RNAi)載體，抑制survivin基因，

5、研究其逆轉(zhuǎn)MDR、提高放、化療敏感性作用，初步探討慢病毒介導(dǎo)survivin沉默在口腔腫瘤基因治療中的應(yīng)用前景。 方法與結(jié)果：第一部分慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默survivin逆轉(zhuǎn)多藥耐藥及增強(qiáng)放射敏感性方法：構(gòu)建靶向survivin的慢病毒RNAi載體，體外轉(zhuǎn)染OSCC多藥耐藥細(xì)胞株C-A120。應(yīng)用半定量RT-PCR與Westernblot檢測基因沉默效果；MTT方法分析細(xì)胞對化療藥物敏感性；克隆形成試驗(yàn)檢測放射敏感性；彗星試驗(yàn)

6、探討survivin是否促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù)。 結(jié)果：RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，survivin在mRNA及蛋白質(zhì)水平被顯著、持久沉默；C-A120細(xì)胞對阿霉素(adriamycin，ADM)及長春新堿(vincristine，VCR)的IC50值分別從2.27、154.21降低至1.61、57.88，耐藥倍數(shù)從12.64、110.94分別降至7.32、41.64(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染對照慢病毒的細(xì)胞未見明顯變化；另外C-A

7、120細(xì)胞對放射敏感性也顯著增加，X射線劑量為8Gy時(shí)，克隆形成率僅為0.02％，低于KB細(xì)胞的0.047％(P＜0.05)；從彗星試驗(yàn)結(jié)果看出，經(jīng)X射線照射后，survivin沉默后的C-A120細(xì)胞彗星尾長為26.30±3.14μm，明顯長于對照組的尾長14.48±2.19μm(P＜0.05)，提示survivin可促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù)。 第二部分慢病毒介導(dǎo)RNAi沉默survivin治療口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌實(shí)驗(yàn)研究方法：構(gòu)

8、建靶向survivin的慢病毒RNAi載體，體外轉(zhuǎn)染口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌KB細(xì)胞株，繪制細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測自發(fā)及藥物誘導(dǎo)凋亡率，MTT試驗(yàn)分析藥物敏感性，克隆形成試驗(yàn)檢測放射敏感性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測慢病毒移植瘤體內(nèi)局部注射對腫瘤的生長抑制作用。 結(jié)果：慢病毒沉默KB細(xì)胞survivin后，細(xì)胞生長在第5天下降了34.2％(P＜0.05)；長春新堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率顯著升高29.8％(P＜0.05)；MTT試3驗(yàn)表明阿霉素IC50

9、值為0.09μg/ml，藥物敏感性是對照組2.1倍(P＜0.01)；克隆形成率在劑量為6Gy的X射線時(shí)為3.7％，比對照組15.3％明顯降低(P＜0.05)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，慢病毒沉默survivin后可抑制KB細(xì)胞體內(nèi)成瘤過程，第35天腫瘤體積僅為1.52±0.36cm3，小于空白對照組的2.41±0.80cm3及對照慢病毒組的2.64±0.71cm3(P＜0.05)。同時(shí)慢病毒局部注射能有效抑制腫瘤組織生長，第25天腫瘤體積為2.49

10、±0.56cm3，小于生理鹽水組的3.67±0.67cm3及對照慢病毒組的3.42±0.74cm3(P＜0.05)。另外聯(lián)合應(yīng)用慢病毒還可以進(jìn)一步提高化療藥物長春新堿的抗腫瘤效果，第25天腫瘤體積為1.54±0.39cm3，生理鹽水組為2.87±0.55cm3，單獨(dú)應(yīng)用長春新堿組為1.97±0.57cm3；但生存分析結(jié)果表明慢病毒聯(lián)合長春新堿組平均生存時(shí)間與生理鹽水組、單獨(dú)應(yīng)用長春新堿組比較并無顯著性差異。 結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)RN