1、研究背景:
　　結(jié)腸癌為臨床常見惡性腫瘤之一,2010年在美國位列腫瘤死亡率第三位,在我國的死亡率則排在第四~六位,在對(duì)近些年我國結(jié)腸癌的發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),總體上呈上升趨勢,雖然結(jié)腸癌患者接受根治性手術(shù)治療及輔助性放化療的治療率高達(dá)70％~80%,但仍有大量患者死于腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的原因有很多,其中重要之一就是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了耐藥。目前針對(duì)腫瘤耐藥的研究已成為腫瘤治療研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。Lin28是一個(gè)

2、高度保守的小RNA結(jié)合蛋白,其亞型Lin28B在結(jié)腸癌腫瘤組織中表達(dá)明顯升高,而且Lin28B能夠促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時(shí)Lin28還是腫瘤干細(xì)胞的表面分子標(biāo)記物,能夠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成并維持腫瘤干細(xì)胞特性。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌等惡性腫瘤中Lin28能夠抑制Let-7的成熟,高表達(dá)Lin28的腫瘤組織中相應(yīng)的Let-7水平下降。而在肺癌中,Lin28能夠誘導(dǎo)肺癌腫瘤細(xì)胞對(duì)放療耐受。小分子RNA(microRNA) Let-7能夠促

3、進(jìn)細(xì)胞分化,與Lin28B存在調(diào)控關(guān)系,在結(jié)腸癌組織中低水平表達(dá)。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn),Lin28B-Let-7與肝癌干細(xì)胞密切相關(guān),干細(xì)胞在誘導(dǎo)腫瘤耐藥方面起著舉足輕重的作用。而在結(jié)腸癌中對(duì)于 Lin28B-Let-7的調(diào)控關(guān)系以及其對(duì)化療藥物敏感性的影響尚不明確,因此我們擬通過以下的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),明確Lin28B-Let-7在結(jié)腸癌中的調(diào)控關(guān)系,并闡明其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞化療敏感性的影響,從而有助于對(duì)逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥性關(guān)鍵靶點(diǎn)的研究。
　　

4、目的:
　　1、在8種人結(jié)腸癌細(xì)胞系中檢測Lin28B的表達(dá),并在人結(jié)腸癌組織中的檢測其表達(dá)情況,進(jìn)而對(duì)其定位表達(dá)進(jìn)行觀察;
　　2、在過表達(dá)Lin28B的結(jié)腸癌細(xì)胞中證實(shí)Lin28B-Let-7調(diào)控環(huán)路的存在;
　　3、過表達(dá)Lin28B/Let-7,觀察其對(duì)化療藥物5-FU敏感性的變化。
　　材料與方法:
　　1、對(duì)8種人結(jié)腸癌細(xì)胞系進(jìn)行PCR檢測,觀察Lin28B表達(dá)情況;Real-time PCR,

5、Western Blot及免疫組化技術(shù)對(duì)解放軍總醫(yī)院海南分院21例結(jié)腸癌和19例正常結(jié)腸組織進(jìn)行檢測,觀察Lin28B表達(dá)情況;
　　2、在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中分別采用免疫熒光法、核漿蛋白分離后行 Western Blot和表達(dá)GFP慢病毒載體感染的方法檢測Lin28B的表達(dá)定位。在人結(jié)腸癌組織中進(jìn)行免疫組化染色以進(jìn)一步確認(rèn)定位觀察;
　　3、在人結(jié)腸癌細(xì)胞系中,分別過表達(dá)Lin28B后觀察Let-7的表達(dá)情況;反之,過表達(dá)Le

6、t-7觀察Lin28B是否受到抑制;最后,檢測過表達(dá)Let-7或Lin28B對(duì)化療藥物5-FU敏感性的影響。
　　結(jié)果:
　　在結(jié)腸癌細(xì)胞系 HCT116、SW620、SW1116、SW480、LOVO、Lim1215、LS174T和DLD1以及結(jié)腸癌組織中均發(fā)現(xiàn)Lin28B有著廣泛的表達(dá),且在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常的結(jié)腸組織。繼而,Lin28B的定位表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到其在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá),且在細(xì)胞漿中呈現(xiàn)

7、高表達(dá)。隨后,通過 Real-time PCR和 Western Blot的結(jié)果驗(yàn)證了Lin28B-Let-7調(diào)控環(huán)路的存在。最后,藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)Let-7的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU化療藥物的敏感性增加,而過表達(dá) Lin28B的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU化療藥物的敏感性降低。
　　結(jié)論:
　　1、在人結(jié)腸癌細(xì)胞系和結(jié)腸癌組織中,Lin28B廣泛的表達(dá),且在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常的結(jié)腸組織;
　　2、Lin28B在結(jié)