1、由外周神經(jīng)損傷、炎癥和腫瘤引起的神經(jīng)病理性疼痛、炎癥痛和癌痛是最常見的三類慢性痛?，F(xiàn)今癌癥已成為威脅人類生存的重要疾病之一。眾所周知，腫瘤引起的疼痛嚴重破壞了患者的生活質(zhì)量，其中以由乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌骨轉(zhuǎn)移引起的骨癌痛最為常見，也最為嚴重。有研究認為，癌痛可能有神經(jīng)痛和炎癥痛兩種成分存在，但與炎癥痛和神經(jīng)痛又不完全相同。在癌痛早期，由于腫瘤與周圍組織釋放炎性因子而表現(xiàn)出與炎癥痛相似的癥狀；在癌痛晚期由于腫瘤細胞的生長浸潤引起

2、神經(jīng)壓迫和損傷，從而表現(xiàn)出與神經(jīng)痛類似的癥狀。這提示癌痛機理有其獨特性和復(fù)雜性。因此將癌痛與神經(jīng)痛、炎癥痛做比較性研究對揭示癌痛獨特的機理有重要的理論和臨床意義。
　　 Toll樣受體(Toll like receptor，TLRs)是一個模式識別受體家族，屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其13個家族成員。它們主要通過識別保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-Associated Molecular Pattern，PAMP)

3、，感知病原微生物的存在，對其產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)。最近發(fā)現(xiàn)TLRs還能識別受損細胞或壞死細胞來源的內(nèi)源性危險信號。這些內(nèi)源性危險信號和PAMP類似，在外周可以促進抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells，APC)的成熟進而激發(fā)T細胞免疫應(yīng)答。熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是TLRs常見的內(nèi)源性激動劑，HSP與TLRs結(jié)合后，能通過髓樣分化因子(myeloid differentiation

4、factor88，MyD88)激活下游信號通路。已有研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的TLR2和TLR4在炎癥痛與神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用，我實驗室前期的工作也發(fā)現(xiàn)TLR4在癌痛的發(fā)生與維持中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。TLR9是TLRs家族中重要一員，近來研究發(fā)現(xiàn)TLR9不僅在外周免疫細胞中表達，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也有廣泛表達，并能調(diào)節(jié)下游的IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子，這些炎性因子在痛覺敏化的過程中有重要的作用。那么脊髓TLR9在癌痛的發(fā)生

5、與發(fā)展中作用如何呢?因此本研究深入地觀察了TLR9在癌痛中的作用。
　　 祖國醫(yī)學對疼痛有著深刻的認識，《黃帝內(nèi)經(jīng)》認為疼痛產(chǎn)生的重要原因是“經(jīng)脈流行不止，環(huán)周不休，泣而不行，脈中則氣不通，故卒然而痛?！?，此外“風、寒、濕三氣雜至合而為痹”。因此“不通則痛”，淤血阻滯，痰凝積結(jié)，濕邪內(nèi)阻，毒火結(jié)聚等阻滯經(jīng)絡(luò)，引起疼痛。針刺是祖國醫(yī)學的精華之一，具有作用廣，毒副作用小，經(jīng)濟簡便等優(yōu)點。針刺能夠疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)節(jié)氣血。大量的臨床實踐證明

6、，針刺療法對急、慢性疼痛均有良好的治療效果，但是針刺對骨癌痛的鎮(zhèn)痛作用尚存在爭議，針刺鎮(zhèn)痛的機理也不是十分清楚。因此本研究觀察了電針對不同性質(zhì)疼痛的鎮(zhèn)痛作用，以期進一步闡述骨癌痛的獨特機理并探索針刺鎮(zhèn)痛新的機理。
　　 綜上所述，本論文擬開展下列研究：
　　 1.建立癌痛、炎癥痛和神經(jīng)痛模型并比較其行為學差異
　　 (1)參照本研究組毛應(yīng)啟梁等之前的報道，建立大鼠脛骨癌痛模型。采用機械性痛覺超敏與熱痛覺過敏等指標

7、檢驗其行為學特征。
　　 (2)建立新的大鼠脛骨炎癥痛模型。采用病理學、血常規(guī)分析、免疫熒光、機械性痛覺超敏與熱痛覺過敏等方法對其進行評價并檢驗其行為學特征。
　　 (3)參照Woolf等建立的SNI(spared nerve injury)模型，并進行改進，新建大鼠脛神經(jīng)病理性疼痛模型，并采用機械性痛覺超敏與熱痛覺過敏等指標檢驗其行為學特征。
　　 (4)通過給予三種疼痛模型大鼠抗炎鎮(zhèn)痛藥塞來昔布灌胃治療，比較

8、三種疼痛模型大鼠對塞來昔布的鎮(zhèn)痛敏感性。
　　 2.比較脊髓TLR9在三種疼痛模型中的作用及其機制
　　 (1)運用RT-PCR方法在mRNA水平比較TLR9在三種疼痛模型中表達變化。
　　 (2)運用Western Blot方法在蛋白水平比較TLR9在三種疼痛模型中表達變化。
　　 (3)采用免疫熒光雙標的方法檢測TLR9在脛骨癌痛大鼠脊髓內(nèi)細胞定位。
　　 (4)通過鞘內(nèi)注射TLR9的拮抗劑O

9、DN2088，比較其對三種疼痛模型大鼠機械性痛閾的影響。
　　 (5)通過鞘內(nèi)注射TLR9內(nèi)源性配體HSP90的抑制劑，17-DMAG(17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin hydrochloride)，比較其對三種疼痛模型大鼠機械性痛閾的影響。
　　 (6)通過Bio-Plex懸液芯片方法檢測TLR9通過下游的細胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL

10、-10與TNF-α的表達變化。
　　 3.比較電針對不同慢性痛的鎮(zhèn)痛作用及其對TLR9表達的影響
　　 (1)觀察多次電針對大鼠脛骨癌痛的鎮(zhèn)痛作用及脊髓TLR9表達的影響。
　　 (2)觀察多次電針對大鼠脛骨炎癥痛的鎮(zhèn)痛作用及脊髓TLR9表達的影響。
　　 (3)觀察多次電針對大鼠脛神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用及脊髓TLR9表達的影響。
　　 實驗結(jié)果如下：
　　 1.建立脛骨癌痛、脛骨炎癥痛和脛神經(jīng)

11、痛模型并通過比較其行為學差異
　　 (1)大鼠脛骨癌痛模型
　　 參照毛應(yīng)啟梁等報道的大鼠脛骨癌痛模型，采用微量進樣器將 Walker256乳腺癌細胞注入大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)。隨著腫瘤細胞的生長，大鼠后肢無明顯熱痛覺過敏，但是產(chǎn)生明顯的機械性痛覺超敏，與之前的報道表現(xiàn)一致，表明該模型建立成功。
　　 (2)大鼠脛骨炎癥痛模型
　　 與脛骨癌痛模型類似，采用微量進樣器將金黃色葡萄球菌(S.aureus)注入大鼠

12、脛骨骨髓腔內(nèi)。隨著細菌的生長，4天后模型大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)產(chǎn)生急性炎癥，8天后發(fā)展為亞急性炎癥，12天后進入慢性炎癥階段，16天后炎癥開始恢復(fù)。血常規(guī)結(jié)果表現(xiàn)出一致的變化，在第4天與第8天白細胞數(shù)量顯著增高，12天后與注射纖維蛋白膠對照組大鼠無顯著差異，血常規(guī)的其它指標未發(fā)現(xiàn)顯著性改變。模型大鼠從術(shù)后2天開始產(chǎn)生明顯的機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。有趣的是模型大鼠雙后肢產(chǎn)生明顯的機械性痛覺超敏，但是只有患肢表現(xiàn)出顯著的熱痛覺過敏。此外，免疫

13、熒光結(jié)果顯示脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞表達顯著增加。表明該炎癥痛模型的建立是成功的、可靠的。
　　 (3)大鼠脛神經(jīng)痛模型
　　 參照Woolf等建立的SNI(spared nerve injury)神經(jīng)痛模型，我們在此只結(jié)扎大鼠的脛神經(jīng)，而保留腓腸神經(jīng)和腓總神經(jīng)的完整。從手術(shù)后第2天開始，大鼠手術(shù)側(cè)后肢表現(xiàn)出明顯的機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏，一直到16天還保持穩(wěn)定的痛覺敏化狀態(tài)，表明該神經(jīng)痛模型是成功的。

14、>　　 (4)三種疼痛模型對塞來昔布的敏感性比較
　　 從術(shù)后第6天給予塞來昔布灌胃治療，持續(xù)到第10天，20mg/kg.day，早晚各一次。在術(shù)后第8天，血藥濃度穩(wěn)定后，觀察不同疼痛模型大鼠對塞來昔布的敏感性。結(jié)果顯示脛骨炎癥痛大鼠對塞來昔布有很好的敏感性，而脛骨癌痛與脛神經(jīng)痛大鼠對塞來昔布的敏感性比較弱。
　　 小結(jié)：通過本部分的研究，我們建立了大鼠脛骨炎癥痛、脛神經(jīng)痛模型作為大鼠脛骨癌痛模型的研究對照模型，并系統(tǒng)

15、的對比了三種模型機械性痛覺超敏、熱痛覺過敏等疼痛行為的差異，此外我們還比較了三種模型大鼠對抗炎鎮(zhèn)痛藥塞來昔布的敏感性。我們的結(jié)果提示，大鼠脛骨癌痛與脛骨炎癥痛、脛神經(jīng)痛行為上既有相似之處，又有不同的地方，提示了骨癌痛可能有神經(jīng)痛與炎癥痛兩種成份共同參與，但又有其獨特的機理。采用脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)模型作為對照模型研究脛骨癌痛的機理有重要的臨床意義，為深入開展大鼠脛骨癌痛的機理研究提供了有效的方法。
　　 2.觀察脊髓TLR9在三種

16、疼痛模型中的作用及其機制
　　 (1)通過RT-PCR的方法檢測TLR9 mRNA在三種模型上的表達變化。結(jié)果顯示，手術(shù)后12天，與正常組大鼠相比，脛骨炎癥痛與脛骨癌痛大鼠脊髓內(nèi)TLR9mRNA的表達顯著升高，而脛神經(jīng)痛大鼠則無明顯的改變。各模型組大鼠手術(shù)同側(cè)和對側(cè)變化趨勢一致。
　　 (2)通過Western-Blot方法檢測TLR9蛋白在三種疼痛模型上的表達變化，結(jié)果顯示，手術(shù)后12天，與各自模型對照組大鼠相比，脛骨

17、癌痛與脛骨炎癥痛大鼠脊髓背角內(nèi)TLR9的表達顯著升高，而脛神經(jīng)痛大鼠TLR9的表達未發(fā)生顯著性的改變。
　　 (3)為了明確脛骨癌痛時TLR9在脊髓背角內(nèi)的表達定位，我們采用免疫雙標的方法進行檢測。結(jié)果表明，TLR9與神經(jīng)元標記物NeuN存在大量共標，但是與星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP和小膠質(zhì)細胞標記物CD11b幾乎無共存。表明在脛骨癌痛時，神經(jīng)元內(nèi)的TLR9大量表達。
　　 (4)為了觀察TLR9在疼痛中的作用，我們通過

18、鞘內(nèi)注射的方法給予三種模型大鼠TLR9的拮抗劑ODN2088，并觀察其對三種疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，ODN2088在給藥后1小時與2小時均能顯著性提高脛骨癌痛、脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)痛大鼠的機械性痛閾，4小時后作用消失。但是產(chǎn)生相同程度的鎮(zhèn)痛作用，脛骨癌痛大鼠所需要的劑量遠遠高于脛骨炎癥痛和脛神經(jīng)痛大鼠。
　　 (5)為了觀察TLR9的內(nèi)源性配體HSP90在疼痛中的作用，我們通過鞘內(nèi)注射的方法給予三種模型大鼠HSP90的抑

19、制劑17-DMAG，并觀察其對三種疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，17-DMAG在給藥后1小時與2小時均能顯著性提高脛骨癌痛、脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)痛大鼠的機械性痛閾，4小時后作用消失。但是產(chǎn)生相同程度的鎮(zhèn)痛作用，脛骨癌痛大鼠所需要的劑量遠遠高于脛骨炎癥痛和脛神經(jīng)痛。
　　 (6)TLR9信號通路下游的細胞因子的表達變化
　　 為了觀察TLR9在疼痛中的作用機制，我們采用Bio-Plex懸液芯片法檢測了細胞因子IL-1β、

20、IL-4、IL-6、IL-10與TNF-α在三種疼痛模型中的表達變化以及ODN2088與17-DMAG對這些細胞因子的表達影響。結(jié)果顯示，脛骨癌痛大鼠脊髓內(nèi)IL-1β的表達顯著升高，鞘內(nèi)給予ODN2088與17-DMAG均能有效下調(diào)IL-1β的表達。脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)痛大鼠脊髓內(nèi)IL-1β沒有顯著變化。此外，IL-4、IL-6、IL-10與TNF-α在三種疼痛模型大鼠的表達均沒有發(fā)生顯著性改變。
　　 小結(jié)：綜上所述，造模12天

21、后，脛骨癌痛大鼠脊髓背角內(nèi)TLR9表達顯著升高，鞘內(nèi)給予TLR9的拮抗劑ODN2088能顯著性的提高脛骨癌痛大鼠機械性痛閾，鞘內(nèi)給予HSP90抑制劑17-DMAG對脛骨癌痛大鼠也有顯著的鎮(zhèn)痛作用。脛骨癌痛大鼠脊髓內(nèi)炎性細胞因子IL-1β表達顯著升高，ODN2088與17-DMAG均能顯著性下調(diào)IL-1β的表達。雖然ODN2088與17-DMAG對脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)痛大鼠也有明顯的鎮(zhèn)痛作用，但是我們所檢測的炎性細胞細胞因子在脛骨炎癥痛與脛

22、神經(jīng)痛中沒有發(fā)生顯著性改變，提示可能通過其它的機制發(fā)揮作用，有待進一步的研究。綜上，這提示HSP90-TLR9-IL-1β信號通路可能是脛骨癌痛所特有的，對此信號通路進行深入的研究有可能為臨床治療骨癌痛提供新的突破點。
　　 3.電針對模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用
　　 為了驗證電針對不同疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用，我們對三種模型大鼠分別給予多次電針治療，針刺穴位為“足三里”與“昆侖”，隔天檢測機械性痛閾，并進一步觀察電針對TLR9表

23、達的影響。
　　 (1)電針對脛骨癌痛大鼠的作用
　　 結(jié)果顯示，給予脛骨癌痛大鼠多次電針治療，對其機械性痛閾沒有顯著性改變，對模型大鼠脊髓內(nèi)TLR9表達無明顯的改變。
　　 (2)電針對脛骨炎癥痛大鼠的作用
　　 結(jié)果顯示，給予脛骨炎癥痛大鼠多次電針治療，能顯著提高其機械性痛閾，并能顯著性降低模型大鼠脊髓內(nèi)TLR9的表達。
　　 (3)電針對脛神經(jīng)痛大鼠的作用
　　 結(jié)果顯示，給予脛神經(jīng)

24、痛模型大鼠多次電針治療，能顯著提高其機械性痛閾，但是對模型大鼠脊髓內(nèi)TLR9的表達無顯著性改變。
　　 小結(jié)：電針對脛骨癌痛大鼠TLR9的表達無顯著性改變，對其機械性痛閾也沒有顯著性的影響。而電針能顯著性下調(diào)脛骨炎癥痛大鼠TLR9的表達，并且能顯著性提高其機械性痛閾。電針對脛神經(jīng)痛大鼠TLR9的表達沒有明顯改變，但是能顯著提高脛神經(jīng)痛大鼠的機械性痛閾。由于脛神經(jīng)痛大鼠本身TLR9的表達不明顯，綜合之前的研究表明電針通過其它的機制

25、參與脛神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛。電針對脛骨癌痛與脛骨炎癥痛的作用表明，TLR9在針刺鎮(zhèn)痛中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　 綜上所述，本研究通過對大鼠脛骨癌痛、脛骨炎癥痛、脛神經(jīng)痛三種不同慢性痛的對比研究，表明脛骨癌痛與脛骨炎癥痛、神經(jīng)痛既有相似之處，又有其獨特性。
　　 1.在行為學表現(xiàn)方面，脛骨癌痛時機械性痛覺超敏顯著而熱痛覺過敏不顯著，提示癌痛有其獨特性。
　　 2.HSP90-TLR9-IL-1β信號通路在大鼠脛骨癌痛的