1、【目的】十溴聯苯乙烷(Decabromodiphenyl ethane,DBDPE)作為多溴聯苯醚類(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)阻燃劑的替代品于上世紀90年代進入市場,由于其高分子量和低脂溶性,在很長一段時間內被認為難以釋放到環(huán)境中、難以被生物降解和利用。2003年,DBDPE首次在淤泥中被檢出,隨后被從室內空氣、污水等介質和生物體內檢出,表明DBDPE與其結構類似物十溴聯苯醚(Decab

2、romodiphenyl ether,BDE-209)一樣,可以進入環(huán)境,并可在環(huán)境、食物鏈以及生物體內發(fā)生蓄積。相關研究顯示,DBDPE人群環(huán)境暴露水平持續(xù)增加,人體蓄積水平呈現較快增加趨勢。因此有必要開展DBDPE對生物體的潛在健康危害研究。目前針對DBDPE的毒理學評價研究開展的比較少。Hardy等開展的嚙齒類動物和水生生物毒性研究表明,DBDPE難以被生物體降解,健康危害風險水平低。Nakari等采用水生生物開展的毒性研究表明,

3、DBDPE可被水生生物降解,并對水生生物具有急性毒性、雌激素樣作用及生殖毒性,但其實驗設計存在一定的缺陷,研究中采用甲苯作為溶劑。此外,目前對DBDPE的代謝和毒作用機制也尚不清楚,而DBDPE的結構類似物PBDEs可作用于機體內分泌系統相關受體,干擾機體內分泌系統和代謝平衡?；谝验_展研究之間的結果差異和DBDPE結構類似物的毒理學特征、毒作用機制,結合肝代謝在溴化阻燃劑(bromoniated flame retardants,BF

4、Rs)毒性作用中的關鍵作用,本研究開展了DBDPE的肝毒性和肝代謝機制研究,以期解決目前研究中存在的問題,獲得準確的實驗數據,為開展進一步研究提供可靠的研究基礎和指明方向。
　　【內容和方法】參考DBDPE結構類似物BDE-209的實驗設計,本研究首先選用人肝癌細胞株HepG2細胞作為實驗對象;采用0-100mg/LDBDPE作為HepG2細胞染毒劑量,選擇二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)作為DBDPE

5、溶劑配制系列染毒液,DMSO在染毒液中濃度保持0.5％(V/V);染毒時間為24h、48h和72h。染毒結束后,采用噻唑藍(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)實驗和L-乳酸脫氫酶(L-Lactic dehydrogenase,LDH)實驗分別對細胞存活率和細胞損傷情況進行測定;采用Hoechst33258染料對染毒后細胞染色,倒置熒光顯微

6、鏡下觀察、記錄細胞變化和損傷程度;采用碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色-流式細胞儀檢測方法測定細胞凋亡情況;為探究細胞損傷和細胞凋亡機制,本研究測定了染毒后活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量;為驗證ROS與細胞損傷和細胞凋亡的關系,染毒前在細胞培養(yǎng)基中加入ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC),染毒結束后,采用MTT實驗和PI染色-流式

7、細胞儀檢測方法分別測定細胞存活率和凋亡情況,分析NAC加入前后ROS生成、細胞存活率和凋亡變化情況,以驗證ROS與細胞損傷的關系。
　　本研究選擇Wistar大鼠作為染毒對象,選擇購自美國雅寶公司的商品化DBDPE產品(DBDPE純度≥98.5%)作為染毒化合物,參照已開展研究實驗設計,設置染毒劑量為0-1000mg/kg/d,選擇經口染毒方式;染毒28天后,測定Wistar大鼠體重、肝臟重量、臟器系數和肝臟功能性損傷生化指標,探

8、討DBDPE對肝臟的損傷情況;考慮到細胞毒性研究中DBDPE可以誘導HepG2細胞ROS含量增加,對相關的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)等氧化損傷指標進行了測定,以期在動物水平驗證氧化損傷與肝臟毒性的關系。此外

9、,本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real time-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技術對不同染毒劑量組的大鼠肝臟多種相關的細胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)在mRNA水平進行了測定;進而采用Westernblot實驗對mRNA水平發(fā)生顯著改變的CYP450酶在蛋白水平進行了測定;采用超高速離心技術獲得大鼠肝臟微粒體,對CYP2B酶對應的PROD(pentoxyr

10、esorufin O-dealkylation)、CYP3A酶對應的LBD(Luciferin benzylether debenzylase)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(Uridinediphosphate-glucuronosyltransferase,UDPGT)活性進行了測定,以分析和推斷DBDPE在肝臟中的代謝情況和作用機制。
　　【結果】在HepG2細胞毒性研究實驗部分,利用0-100.0mg/LDBDPE對HepG

11、2細胞染毒24h、48h和72h,MTT實驗、LDH實驗和細胞形態(tài)學觀察實驗表明,DMSO對細胞存活率、細胞損傷程度以及Hoechst33258染色細胞形態(tài)學改變的影響與對照組之間無顯著性差異;0-6.25mg/L劑量染毒24h、48h和72h后細胞存活率、細胞損傷程度以及細胞形態(tài)學改變與對照組相比無顯著性差異;12.5-100.0mg/L劑量染毒48h和72h可降低細胞存活率、增加細胞損傷程度和引起細胞形態(tài)學顯著改變,具有明顯的時間和

12、劑量-反應關系;PI染色-流式細胞儀檢測發(fā)現,12.5-100mg/L劑量DBDPE可誘導HepG2細胞凋亡,存在時間和劑量-反應關系;研究還發(fā)現,DBDPE可誘導HepG2細胞ROS生成量增加,通過NAC驗證試驗,證實DBDPE誘導的細胞凋亡和損傷與ROS有關。
　　在DBDPE對Wistar大鼠染毒動物毒性研究中,采用0-1000mg/kg劑量DBDPE對Wistar大鼠連續(xù)經口染毒28天后發(fā)現,DBDPE染毒后Wistar大

13、鼠體重、肝臟重量、臟器系數等指標與對照組相比,無顯著性差異;血清學檢測發(fā)現,較高劑量組DBDPE可誘導雄性Wistar大鼠乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙轉氨酶(Glutamic pyruvic transaminase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate transaminase,AST)、膽汁酸(Total bile acid,TBA)、總膽紅素(total bilirubin,TBA)和

14、葡萄糖(Glucose,Glu)的顯著改變,部分劑量組還可誘導γ-谷氨酰轉移酶(glutamyl transpeptidase,GGT)、血漿總蛋白(Total protein,TP)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、尿素氮(urea nitrogen,UN)和肌酐(Creatinine,Cr)的顯著改變;此外,較高劑量組DBDPE還可誘導雌性Wistar大鼠堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、A

15、ST和Glu的顯著改變,部分劑量組還可誘導TBA、Cr和TG的顯著改變。此外,中高DBDPE染毒劑量組GSH水平與對照組存在顯著性差異,結合DBDPE可致HepG2細胞ROS生成量增加,提示DBDPE可能致肝臟發(fā)生氧化損傷。上述結果表明,DBDPE對大鼠具有肝毒性,可引起肝損傷,還可影響大鼠膽汁排泄等功能和正常糖等的代謝,且相關研究結果提示DBDPE可能干擾肝臟脂肪和蛋白的代謝,分析DBDPE可能具有一定的內分泌干擾作用,可能通過干擾機

16、體內分泌途徑,啟動機體某些信號通路,干擾機體正常代謝功能;還可能通過氧化損傷等作用引起肝損傷,進而引起代謝功能受損。
　　DBDPE對Wistar大鼠染毒后,肝CYP450代謝酶mRNA、蛋白和酶活性檢測發(fā)現,染毒組CYP1A1/2mRNA與對照組相比無顯著性差異,提示DBDPE可能具有較低或無二噁英樣毒性作用;CYP2B1和CYP3A1/3mRNA與對照組相比無顯著性差異;雄性大鼠CYP2B2、CYP3A2在三個水平上,較高劑量

17、組與對照組相比存在顯著差異;雌性大鼠CYP2B2、CYP3A2在三個水平上,個別劑量組與對照組相比存在顯著差異;UDPGT活性檢測表明,較高劑量組DBDPE對雄性大鼠UDPGT活性具有誘導作用,并具有一定的劑量反應關系;僅500mg/kg.d劑量組DBDPE對雌性大鼠UDPGT活性的影響與對照組存在顯著性差異。據此推測DBDPE對Wistar大鼠代謝酶的影響存在一定的性別差異,對雄性Wistar大鼠影響較大;分析認為DBDPE可能通過激

18、活組成型雄烷受體(constitutive androstane receptor,CAR)和孕烷X受體(pregnane xenobiotic receptor,PXR)信號通路,進而誘導肝臟Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶對DBDPE進行代謝以及干擾Wistar大鼠內分泌系統,影響Wistar大鼠體內正常代謝穩(wěn)態(tài),發(fā)揮毒性作用。
　　【結論】DBDPE具有一定的肝毒性,ROS和氧化損傷分別在肝細胞毒性和大鼠肝損傷中發(fā)揮重要作用;DBDPE可能