1、CEA是人們認(rèn)識(shí)最早的腫瘤相關(guān)抗原之一，它在胎兒的結(jié)腸表面表達(dá)量很高，而在成人CEA濃度很低。但成人患惡性腫瘤和某些炎性疾病時(shí)，CEA表達(dá)量會(huì)明顯升高。統(tǒng)計(jì)學(xué)資料表明大腸癌的CEA表達(dá)率為83.3％，肝癌為80％，肺癌為76.6％，乳腺癌為63.2％。CEA本質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白，分子量180kDa。免疫熒光技術(shù)證明CEA存在于腫瘤細(xì)胞膜上，是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)蛋白，且在細(xì)胞膜上的表達(dá)率有所不同。雜交瘤技術(shù)的建立使CEA單抗廣泛用于生物學(xué)

2、研究和醫(yī)學(xué)檢測(cè)與腫瘤治療，但其鼠源性引起的人抗鼠反應(yīng)(HAMA)以及完整單抗分子過(guò)大難以進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)限制了其發(fā)展。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)使得在細(xì)菌中克隆人的抗體基因、構(gòu)建抗體文庫(kù)、制備人源單克隆抗體成為現(xiàn)實(shí)，尤其通過(guò)該技術(shù)在體外模擬抗體生成過(guò)程，達(dá)到了不經(jīng)免疫制備抗體，展示了誘人的前景。 在構(gòu)建抗體庫(kù)時(shí)有諸多因素對(duì)庫(kù)的質(zhì)量有影響，最重要的是抗體基因的多樣性和成熟度，以及庫(kù)容量的大小。因此，我們?cè)诮◣?kù)時(shí)注意到(1)標(biāo)本取自腸系膜淋

3、巴結(jié)。淋巴結(jié)是哺乳類特有的，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要器官。其淋巴小結(jié)內(nèi)95％的細(xì)胞為B細(xì)胞，且大多為轉(zhuǎn)化的大B細(xì)胞。這些B細(xì)胞受濾泡樹(shù)突細(xì)胞表面聚集的抗原的選擇作用，已經(jīng)過(guò)數(shù)次分裂和膜抗體結(jié)構(gòu)突變過(guò)程，只有其膜抗體與表面抗原有高度親和性的細(xì)胞才能保留繼續(xù)分裂和分化，其余的則均被淘汰，所以選擇淋巴結(jié)最終會(huì)獲得高親合力的抗體。(2)標(biāo)本來(lái)源于高表達(dá)CEA(＞10ng/ml)的結(jié)、直腸癌患者，以使得細(xì)胞中含高豐度的抗體mRNA。(3)提取總RNA時(shí)

4、，強(qiáng)調(diào)RNA的完整性，增加提取和純化RNA的步驟會(huì)減少RNA的多樣性，影響庫(kù)容，所以RNA的純度達(dá)到OD260/OD280的值在1.6以上即可。(4)先構(gòu)建輕鏈庫(kù)，后與克隆的重鏈基因相連，保證重鏈基因的多樣性。(5)制備高質(zhì)量的感受態(tài)細(xì)胞，嚴(yán)格電轉(zhuǎn)化操作，使空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率達(dá)到109才能保證庫(kù)容達(dá)到107以上。從大腸癌患者的腸系膜淋巴結(jié)中一步法提取淋巴細(xì)胞總RNA約20μg，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將十個(gè)患者的cDNA混合在一起，用PCR擴(kuò)增κ

5、鏈和Fd段的基因(Fd段約700bp，κ鏈約640bp)。κ鏈基因經(jīng)純化、酶切、連接和電轉(zhuǎn)化，構(gòu)建κ鏈基因文庫(kù)，含2.5×107個(gè)轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑取10個(gè)菌落行SacI+XbaI酶切檢測(cè)，重組率為70％。Fd段擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到κ鏈基因文庫(kù)質(zhì)粒中，計(jì)數(shù)集落測(cè)定庫(kù)容為5.2×106。XhoI+SpeI酶切檢測(cè)，F(xiàn)d段重組率為90％。用SacI+SpeI酶切檢測(cè)，F(xiàn)ab(約1400bp)重組率為30％。 在篩選抗體庫(kù)過(guò)程中，噬菌體種類、固

6、相介質(zhì)表面抗原密度或溶液中抗原濃度和清洗時(shí)間三個(gè)因素對(duì)篩選效率影響最大。噬菌體的影響隨利類不同，沒(méi)有一定規(guī)律，后兩個(gè)因素是指篩選的嚴(yán)密度。因本次構(gòu)建的抗體庫(kù)Fab重組率為30％，所以采用了五輪篩選，前兩輪采用中等的嚴(yán)密度，避免高親和力但低表達(dá)的噬菌體克隆丟失。后三輪嚴(yán)格篩選條件達(dá)到了篩選目的。第五輪Fab重組率達(dá)到100％，噬菌體滴度比第三輪增加了30倍。從第五輪篩選后得到的細(xì)菌菌落中挑取30個(gè)克隆制備單克隆噬菌體抗體，用ELISA測(cè)定

7、其抗原結(jié)合活性，其中有6個(gè)克隆呈陽(yáng)性(以P/N＞4判定為陽(yáng)性)，陽(yáng)性率為20％。 挑選4株陽(yáng)性噬菌體抗體感染大腸桿菌XL1-Blue，擴(kuò)增后提取噬菌粒，構(gòu)建可溶性Fab表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集培養(yǎng)液上清及菌體裂解液上清。ELISA、Westernblot檢測(cè)均證實(shí)有3個(gè)克隆成功地表達(dá)了可溶性的Fab抗體蛋白，可溶性抗體與人CEA有特異結(jié)合活性。通過(guò)對(duì)克隆1的可變區(qū)進(jìn)行序列測(cè)定分析與GenBan

8、k檢索，證實(shí)其與人免疫球蛋白IgG重鏈VH3堿基同源性為90％，氨基酸同源性為88.9％，差異主要集中在CDR2、CDR3區(qū)，輕鏈V區(qū)與人免疫球蛋白Vκ1堿基同源性為93％，氨基酸同源性為91％，CDRl、CDR2、CDR3區(qū)均存在氨基酸差異。根據(jù)同一家族中核苷酸序列同源性大于80％，說(shuō)明所獲抗體基因重鏈屬于人抗體VH3家族，輕鏈屬于人抗體Vκ家族。 本研究以噬菌體展示技術(shù)得到了抗CEA的單克隆抗體并證實(shí)了該抗體的有效性，希望使