1、目的:本研究在成功建立大鼠原位肝移植模型的基礎(chǔ)上，圍手術(shù)期早期應(yīng)用Gln強(qiáng)化的腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液能全力進(jìn)行腸內(nèi)營養(yǎng)，通過檢測反映腸粘膜屏障狀況的相關(guān)指標(biāo)的動態(tài)變化，從免疫學(xué)、分子生物學(xué)和微生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域系統(tǒng)探討肝移植腸粘膜屏障的損傷狀況以及Gln強(qiáng)化的EEN能否對肝移植腸粘膜損傷具有保護(hù)作用，為減輕肝移植腸道損傷，減少肝移植并發(fā)癥，提高其存活率采取有效措施提供動物實驗依據(jù)，具有重要的臨床意義。 方法:健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為

2、正常對照組 (Control組)、原位肝移植組(OLT組)和原位肝移植+Gin強(qiáng)化的早期腸內(nèi)營養(yǎng)組(EEN組)。以未經(jīng)任何處理的大鼠為正常對照組；EEN 組受體術(shù)前第 3d、第2d、第1d及術(shù)后3h開始給予腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液能全力(125ml/d/kg)+谷氨酰胺(0.3g/d/kg)灌胃，均勻分 6 次給予，期間自由飲水，直至動物處死為止。OLT 組受體于相應(yīng)時間點按同樣方法給予等容積的生理鹽水。以未經(jīng)任何處理的大鼠為供體，兩袖套法建立大

3、鼠原位肝移植模型。按肝移植后12h、24h和72h分為三個亞組。于每個時間點采集血液和組織標(biāo)本。用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)Pyrochrome Kit，采用終點法檢測門靜脈血漿內(nèi)毒素水平；酶學(xué)分光光度法檢測門靜脈血漿 D-乳酸含量；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定下腔靜脈血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量；光鏡及電鏡檢查回腸粘膜的病理改變情況；硫代巴比妥酸法測定腸粘膜丙二醛(MDA)含量；放射免疫測

4、定腸組織中分泌型免疫球蛋白 A (slgA)含量；取門靜脈血，腸系膜淋巴結(jié)(MLN)、肝、脾組織作細(xì)菌培養(yǎng)；免疫組織化學(xué)法檢測腸粘膜NF-κB、ICAM-1的表達(dá)；熒光定量 PCR 和 Western blotting 檢測腸組織TNF-αmRNA 和TNF-α蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果: (1)肝移植后12h、24h和72h，OLT組內(nèi)毒素水平分別為0.427±0.092，0.907±0.057 和 0.803±0.052E

5、U/ml，EEN 組分別為0.413±0.056，0.617±0.049和0.406±0.043EU/ml，均明顯高于正常對照組0.109±0.017 EU/ml (P<0.01)；EEN組24h、72h分別與OLT組24h、72h比較，有顯著性差異(P<0.01)，分別下降32.0％、49.4％。 (2)肝移植后12h、24h和72h，OLT組D-乳酸含量分別為1.23±0.12，2.30±0.12和1.92±0.11μg/m

6、l，EEN 組分別為1.22±0.11，1.78±0.10 和1.23±0.08μg/ml，均明顯高于正常對照組0.48±0.07μg/ml(P<0.01)；EEN組24h、72h分別與OLT組24h、72h比較，有顯著性差異(P<0.01)，分別下降22.6％、35.9％。 (3)肝移植后12h、24h和72h，OLT組血清TNF-α含量分別為107.06±7.47，759.04±24.1 4 和 569.17±26.70pg

7、/ml，EEN組分別為102.28±9.61，715.50±25.73和521.13±20.86pg/ml，均明顯高于正常對照組15.98±2.07 pg/ml(P<0.01)；EEN組24h、72h低于OLT組24h、72h，有顯著性差異(P<0.01)，分別下降5.74％、8.44％。 (4)肝移植后12h、24h和72h，光鏡下見OLT組回腸粘膜彌漫性重度糜爛、壞死脫落，絨毛間隙增寬，固有層水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤，粘膜變薄

8、，以24h最重；而EEN組輕度糜爛，灶性壞死、只有輕度水腫和少量炎性細(xì)胞浸潤；OLT組絨毛長度分別為276.5±16.9，152.1±11.3和199.3±11.6μm，EEN 組分別為283.9±15.7，228.1±14.9 和289.9±10.8μm，均明顯低于正常對照組383.3±14.1μm(P<0.01)；但EEN組24h、72h明顯高于OLT組(P<0.01)，分別是后者的1.50、1.45倍。透射電鏡下見OLT組24h腸

9、粘膜上皮細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞溶解，微絨毛壞死、脫落，而EEN組上皮細(xì)胞間隙基本正常、線粒體輕度腫脹、微絨毛輕度空泡化和局部壞死脫落。 (5)肝移植后12h、24h和72h，OLT組腸粘膜MDA含量分別為 18.95±1.33，37.13μ±1.46 和31.30±1.12nmol/mg.prot，EEN 組分別為17.91±1.12，24.88±1.10 和19.40±0.91nmol/mg.prot，均明顯高于正常對照組8.21

10、±0.61nmol/mg.prot(P<0.01)；EEN組12h、24h和72h分別與OLT組12h、24h和72h比較，有顯著性差異(P<0.01)，分別下降5.5％、33.0％、38.0％。 (6)肝移植后12h、24h、72h，OLT組腸粘膜Slga含量分別為0.733±0.036，0.546±0.042 和 0.580±0.037μg/ml，EEN組分別為0.755±0.039，0.722±0.029和0.905±0.

11、030μg/ml，除了EEN組72h與正常對照組無顯著性差異外，其余各組明顯低于正常對照組0.887±0.045μg/ml(P<0.01)；EEN 組 24h、72h分別與OLT組24h、72h比較，有顯著性差異(P<0.01)，分別是后者的1.32、1.56倍。 (7)肝移植后12h、24h和72h，OLT 組腸道細(xì)菌臟器移位率分別為52.50％、82.50％和72.50％，EEN組分別為47.50％、45.00％和32.50

12、％，均明顯高于正常對照組5.00％(P<0.00227)，EEN組24h、72h明顯低于OLT組24h、72h(P<0.00227)，分別下降了45.5％、55.2％。 (8)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：肝移植后12h、24h和72h，OLT組腸組織NF-κB表達(dá)光密度值分別為0.1494±0.0167、0.2018±0.0139和0.1623±0.0142，EEN 組分別為0.1119±0.0091、0.1437±0.0102和0.

13、1087±0.0109，均明顯高于正常對照組0.0606±0.0147(P<0.01)；肝移植后12h、24h和72h，OLT組腸組織ICAM-1表達(dá)光密度值分別為0.1380±0.0136、0.1750±0.0086 和 0.1604±0.0077，EEN組分別為0.1097±0.0064、0.1289±0.0075和0.1086±0.0050，均明顯高于正常對照組0.0464±0.0053(P<0.01)；NF-κB主要表達(dá)于表面上

14、皮和隱窩上皮細(xì)胞，亦表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞；ICAM-1主要表達(dá)于上皮細(xì)胞或小血管內(nèi)皮細(xì)胞；EEN組12h、24h和72h NF-κB、ICAM-1表達(dá)明顯低于OLT組12h、24h和72h(P<0.01)。 (9)熒光定量PCR結(jié)果表明：肝移植后12h、24h和72h，OLT組腸組織TNF.amRNA表達(dá)分別為4.20±0.23，9.40±0.19，5.43±0.27×10<'4>copies/μgRNA，EEN 組分別為3.01

15、±0.10，5.54±0.19，2.61±0.14×10<'4>copies/μgRNA，均明顯高于正常對照組(P<0.01)；但EEN組12h、24h和72h TNF.amRNA表達(dá)明顯低于OLT組12h、24h和72h(P<0.01)，分別下降28.3％、41.1％、51.9％。 (10)Western blotting 結(jié)果表明：肝移植后12h、24h和72h均可檢測到TNF-α蛋白表達(dá)，但EEN組表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱；半定量

16、分析結(jié)果：OLT組TNF-α蛋白分別為1.75，3.40，2.79，EEN組分別為1.32，2.08，1.36，EEN組與OLT組相比分別下降24.6％、38.8％、51.3％。 結(jié)論: (1)原位肝移植無肝期導(dǎo)致腸淤血和腸缺血再灌注損傷，引起腸粘膜上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，腸粘膜MDA含量增加、SIgA水平降低，同時激活腸粘膜巨噬細(xì)胞NF-κB活性，產(chǎn)生TNF-α、ICAM-1等細(xì)胞因子，使腸粘膜屏障功能受到嚴(yán)重?fù)p害，表

17、現(xiàn)在以下幾個方面：①機(jī)械屏障受損：上皮細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙增寬，絨毛壞死脫落，萎縮變短；②生物屏障和免疫屏障受損：表現(xiàn)為細(xì)菌和內(nèi)毒素移位；③腸通透性增加，血D-乳酸含量升高。 (2)Gln 強(qiáng)化的 EEN 能改善肝移植大鼠腸粘膜血供，降低腸粘膜MDA 的產(chǎn)生，有助于腸道細(xì)胞正常分泌SIgA，抑制腸粘膜巨噬細(xì)胞NF-κB活性，減少TNF-α、ICAM-1等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而改善肝移植腸粘膜損傷情況，明顯抑制細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位。但其