1、目的:
　　 在基因水平上探討Toll樣受體4(Toll-like receptor-4,TLR4)是否參與介導(dǎo)了黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFGl)對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolartypeⅡ epithelial cells,AT-Ⅱ cells)的損傷生物學(xué)效應(yīng),以及其在此反應(yīng)過程中的作用機(jī)制和途徑。
　　 方法:
　　 1.用胰酶消化和免疫粘附貼壁選擇的方法分離、純化大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞

2、。并且按照參考文獻(xiàn)中所述配成三個不同濃度的黃曲霉毒素G1(AFGl)液體。純化后AT-Ⅱ cells用20％DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為(1-2)×109/L,并接種于六孔培養(yǎng)板。細(xì)胞培養(yǎng)24h后,更換10％DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h進(jìn)行實驗。本實驗隨機(jī)分3組。第1組:正常組(A組),在實驗組AFGl作用于AT-Ⅱcells的同時加入同等量的無菌生理鹽水處理24小時后提取細(xì)胞mRNA進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。第2組:實驗組(B組),據(jù)AF

3、Gl液作用濃度不同,又分為B1組:濃度為0.5 mg/L,B2組:濃度為1.0 mg/L和B3組:濃度為2.0mg/L。在AFGl同時作用24小時后提取各組細(xì)胞mRNA進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。第3組:溶劑對照組(C組),在實驗組AFGl作用于AT-Ⅱcells的同時加入同等量的DMSO(0.4mL/L)處理24小時后提取細(xì)胞mRNA進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。每組6個樣本。
　　 2.采用Trizol試劑提取各組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的總RNA,紫外

4、分光光度計測定RNA的濃度,以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后以cDNA為模板,以待測定的各指標(biāo)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)成像,用Quantity One分析軟件進(jìn)行凝膠掃描分析,以目的基因/β-actin為該基因表達(dá)的相對值。檢測各組TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達(dá)水平及其變化,在基因水平上證明TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程。
　

5、　 3.統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,以SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析等處理。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.正常組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞上既有TLR4 mRNA的表達(dá),但表達(dá)量較低。實驗組細(xì)胞以AFGl液(濃度分別為0.5,1.0和2.0mg/L)作用后,TLR4 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.05)和溶劑對照組(P<0.05),且呈濃度依賴性增高

6、。溶劑對照組的TLR4 mRNA表達(dá)量與正常對照組相比,無明顯差異(P>0.05)。
　　 2.正常組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的NF-кBmRNA的表達(dá)量較低,實驗組經(jīng)AFGl液作用后NF-кBmRNA的表達(dá)量較正常組和溶劑對照組明顯升高(P<0.05),并呈濃度依賴性增高。溶劑對照組的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的NF-кBmRNA的表達(dá)量與正常組相比,無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.正常組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的TNF-α mRNA和

7、IL-6mRNA表達(dá)水平較低,實驗組在AFGl液作用后,TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達(dá)水平較正常組明顯升高(P<0.05),且隨AFGl液作用濃度的升高而表達(dá)逐漸增強(qiáng)。溶劑對照組TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達(dá)水平與正常對照組相比,無明顯差異(P>0.05),但明顯低于實驗組TNF-αmRNA和IL-6mRNA的水平的表達(dá)(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.AFGl誘使AT-Ⅱcells的T