1、目的：肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類生命與健康的最常見的惡性腫瘤之一，已成為各種惡性腫瘤死亡的首要原因。據(jù)統(tǒng)計，在歐美國家和我國大城市中，肺癌的發(fā)病率已居男性各種腫瘤的首位，肺癌總的5年生存率低于15％，其主要原因是大部分肺癌患者確診時已為進(jìn)展期，喪失了有效的手術(shù)治療時機(jī)。目前肺癌發(fā)生的確切分子機(jī)制尚未充分闡明，因此了解肺癌的形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對其診斷和防治具有重要的理論意義和實用價值。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤死亡的主要原因之

2、一，但腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的途徑和機(jī)制尚有許多不明之處有待探討。乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是1999年Vlodavsky等克隆出來的一種內(nèi)糖苷酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中的硫酸乙酰肝素(heparansulfate，HS)。最近研究發(fā)現(xiàn)，HPSE在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要作用，并且與腫瘤新生血管的形成具有密切關(guān)系。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測HPSE在人非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)，探討HPS

3、E的表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系；在體外實驗中分別檢測乙酰肝素酶反義寡核苷酸(heparanase antisense oligodeoxynucleotide，HPSE ASODN)對人肺癌A549細(xì)胞HPSE mRNA和蛋白表達(dá)的影響，運用MTT法和侵襲實驗探討HPSEASODN對A549細(xì)胞生長和侵襲力的抑制作用。通過裸鼠人肺癌A549細(xì)胞皮下移植瘤模型，探討HPSE ASODN對人肺癌A549細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作

4、用。
　　 方法：應(yīng)用免疫組化法檢測HPSE蛋白在52例非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)，結(jié)合患者的臨床病理學(xué)特征及預(yù)后進(jìn)行分析。設(shè)計合成互補(bǔ)于HPSE mRNA起始密碼區(qū)的HPSEASODN，實驗分ASODN組、脂質(zhì)體組和對照組三組，以陽離子脂質(zhì)體Lipofectin包埋后轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用Western blot法和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain

5、reaction，RT-PCR)法檢測肺癌A549細(xì)胞HPSE蛋白及其mRNA表達(dá)的變化；以Transwell細(xì)胞侵襲試驗檢測HPSE ASODN對肺癌A549細(xì)胞侵襲力的抑制作用。將ASODN轉(zhuǎn)染成功的人肺癌A549細(xì)胞注射于裸鼠皮下建立移植瘤模型，觀察移植瘤生長曲線，應(yīng)用免疫組化方法檢測移植瘤內(nèi)微血管密度(microvessel density，MVD)，比較三組間的差異。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)使用x±s描述，兩

6、組間指標(biāo)比較采用t檢驗，多組間指標(biāo)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：⑴乙酰肝素酶在人非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其意義。免疫組化法研究結(jié)果表明，HPSE蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中存在高表達(dá)，其陽性表達(dá)率為63.5％；不同病理類型肺癌組織中HPSE蛋白陽性表達(dá)率(66.7％、56.3％)無顯著性差異(P>0.05)；不同分化程度肺癌組織中HPSE蛋白陽性表達(dá)率(63.6％、57.9％、68.2％)

7、亦無顯著性差異(P>0.05)；在TNM分期中，Ⅲ期肺癌組織中HPSE蛋白陽性表達(dá)率(80.0％)顯著高于Ⅱ期(61.5％)和Ⅰ期(45.5％)的肺癌組織(P<0.05)；生存3年以下患者的肺癌HPSE蛋白陽性表達(dá)率(82.6％)顯著高于生存3年以上者(48.3％)(P<0.05)。⑵乙酰肝素酶反義寡核苷酸抑制肺癌A549細(xì)胞侵襲力的體外研究。RT-PCR結(jié)果顯示：對照組和脂質(zhì)體組之間比較，HPSE mRNA表達(dá)無明顯差異；ASODN各

8、組分別與對照組和脂質(zhì)體組比較及ASODN各不同濃度組間HPSEmRNA表達(dá)具有明顯差異；隨著ASODN濃度的增加，HPSE mRNA表達(dá)逐漸下降，ASODN的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。Western blot結(jié)果顯示ASODN各組HPSE蛋白的表達(dá)受到明顯抑制，與對照組和脂質(zhì)體組比較，具有明顯差異，并且隨著ASODN濃度的增加，HPSE蛋白的表達(dá)量逐漸下降，ASODN的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示

9、：對照組和脂質(zhì)體組之間比較，侵襲細(xì)胞數(shù)無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組和脂質(zhì)體組比較，ASODN各濃度組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；隨著ASODN濃度的增加，ASODN各組侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ASODN對細(xì)胞侵襲力的抑制作用呈明顯劑量依賴性，ASODN在終濃度為100、200、400 nmol/L時對A549細(xì)胞侵襲力的抑制率分別為49.2％、73

10、％、87.5％。⑶乙酰肝素酶反義寡核苷酸對裸鼠人肺癌細(xì)胞A549皮下移植瘤的抑制作用。脂質(zhì)體組和對照組移植瘤體積較大，兩組腫瘤體積比較無明顯差異(P>0.05)。ASODN組成瘤時間晚，移植瘤體積明顯小于脂質(zhì)體組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ASODN組、脂質(zhì)體組和對照組移植瘤的MVD計數(shù)分別為13.5±1.8，24.3±2.5和24.7±2.6；脂質(zhì)體組和對照組比較，兩組MVD計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與脂質(zhì)

11、體組、對照組比較，ASODN組微血管密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：①HPSE的表達(dá)在肺癌不同的TNM分期中有明顯差異，和患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示HPSE對肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移具有一定的促進(jìn)作用，可作為判斷肺癌轉(zhuǎn)移潛能和患者預(yù)后的一個參考指標(biāo)。②HPSE ASODN在體外通過下調(diào)HPSE mRNA和HPSE蛋白的表達(dá)可顯著抑制肺癌A549細(xì)胞的生長和侵襲，并且抑制作用呈劑量依賴性。③HPSE ASODN