1、一、方法 1．制作臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.hy926)缺氧模型，檢測(cè)常氧和缺氧1 h、3 h、6 h、12 h各時(shí)相點(diǎn)ICAM-1、HIF-1α蛋白表達(dá)情況。 2．將細(xì)胞分為常氧組和缺氧3 h組，分別提取總RNA，依照Invitrogen公司LongSAGE kit說(shuō)明，構(gòu)建常氧和缺氧3 h臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Long SAGE文庫(kù)，具體操作簡(jiǎn)述如下：制備mRNA，合成cDNA雙鏈，錨定酶酶切后的cDNA片段等分兩份，分別與A

2、、B接頭連接；然后以標(biāo)簽酶酶切，并連接形成雙標(biāo)簽；PCR擴(kuò)增，分離純化雙標(biāo)簽；雙標(biāo)簽隨機(jī)連接形成串聯(lián)子并將其克隆至pZero載體中，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件分析，獲得標(biāo)簽序列及豐度信息，通過(guò)與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確認(rèn)基因。 3．生物信息學(xué)分析：通過(guò)NCBI ftp://ftpl.nci.nih.gov/pub/SAGE/HUMAN/Hs long.best gene.gz平臺(tái)分析去除多重匹配標(biāo)簽中的冗余標(biāo)簽，統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)P值<0

3、.05的有意義標(biāo)簽，納入后續(xù)分析(信號(hào)途徑活化分析除外)；根據(jù)單一匹配有意義標(biāo)簽在2個(gè)LongSAGE文庫(kù)中差異表達(dá)，總結(jié)缺氧后表達(dá)明顯上調(diào)和下調(diào)的基因；通過(guò)制作MA散點(diǎn)圖了解缺氧和常氧兩個(gè)SAGE文庫(kù)中標(biāo)簽的分布情況；制作常氧和缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)圖譜；采用在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.discover.nci.nih.gov/gominer/)，基于GO (Gene Ontology，有譯為“基因本體”或者“基因注釋”)生

4、物信息學(xué)系統(tǒng)，對(duì)SAGE文庫(kù)中P值小于0.05的差異表達(dá)基因進(jìn)行了基因功能注釋和分類(lèi)；基因富集分析采用PERL程序(geneid2path.pl)，通過(guò)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)平臺(tái)預(yù)測(cè)分析缺氧早期血管內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)通路與生化途徑改變。 4．常氧和缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的驗(yàn)證：RNA水平的驗(yàn)證采用熒光定量PCR，對(duì)SAGE文庫(kù)中隨機(jī)挑選的5個(gè)已知基因進(jìn)行驗(yàn)證，比

5、較缺氧后其在RNA水平變化是否與SAGE文庫(kù)中所得結(jié)果相符。采用結(jié)合標(biāo)簽的基因序列延伸(GLGI)技術(shù)對(duì)從文庫(kù)中選取的3個(gè)無(wú)匹配標(biāo)簽進(jìn)行擴(kuò)增，確定其是否屬于未知新基因。與常氧和缺氧基因表達(dá)譜相關(guān)蛋白質(zhì)驗(yàn)證采用Western blot檢測(cè)缺氧后VEGF、PCNA蛋白表達(dá)變化。與常氧和缺氧基因表達(dá)譜相關(guān)細(xì)胞功能驗(yàn)證采用細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制缺氧前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、流式細(xì)胞儀分析缺氧后細(xì)胞周期改變、以及Annexin V方法檢測(cè)短暫缺氧后細(xì)胞凋亡發(fā)生率，

6、對(duì)缺氧早期促細(xì)胞增殖和凋亡效應(yīng)等方法進(jìn)行驗(yàn)證。 5．Western blot檢測(cè)缺氧后血管內(nèi)皮細(xì)胞Integrin β1蛋白表達(dá)變化；轉(zhuǎn)染Integrinβ1全長(zhǎng)啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后行缺氧3 h處理，檢測(cè)缺氧前和缺氧后不同時(shí)間Integrin β1啟動(dòng)子活性變化；構(gòu)建Integrin β1熒光小RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞，篩選穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株，通過(guò)繪制常氧、缺氧狀態(tài)下正常EA.hy926細(xì)胞

7、和下調(diào)表達(dá)細(xì)胞株生長(zhǎng)曲線，對(duì)Integrin β1在缺氧早期促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖效應(yīng)中的作用進(jìn)行了初步研究。 二、結(jié)果 1．通過(guò)Long SAGE技術(shù)構(gòu)建了常氧和缺氧臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Long SAGE文庫(kù)，缺氧SAGE文庫(kù)測(cè)得30,756個(gè)標(biāo)簽，其中識(shí)別出的基因(即unique tag)總數(shù)為13879，比例為45.13％；重復(fù)的雙標(biāo)簽體總數(shù)為762，比例為2.40％。常氧SAGE文庫(kù)測(cè)得標(biāo)簽數(shù)為31213，其中識(shí)別出的基因

8、總數(shù)為13665，比例為43.78％；重復(fù)的雙標(biāo)簽體總數(shù)為758，比例為2.40％。文庫(kù)中共有112個(gè)基因表達(dá)量出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，涵蓋編碼細(xì)胞代謝酶類(lèi)，核糖體蛋白，生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)因子等，其中缺氧后明顯上調(diào)的基因?yàn)?2個(gè)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GPCR5A和C11ORF13，以及促血管生成因子ANGPLT4等；而顯著下調(diào)基因?yàn)?0個(gè)，包含參與離子結(jié)合和防御反應(yīng)的基因如HMOX1、SOD1、FTH1、CTGF、OT

9、UB1等；這些基因被視為缺氧后有顯著差異表達(dá)的基因，納入后續(xù)生物信息學(xué)分析中。 2．生物信息學(xué)分析：綜合基因富集分析和GO分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)缺氧早期由于負(fù)調(diào)控增殖基因群的表達(dá)受到明顯抑制(共有4個(gè)負(fù)調(diào)控基因出現(xiàn)顯著差異表達(dá)，其中CAV1，GJA1，HMOX1表達(dá)下調(diào)，NME1表達(dá)上調(diào))，總趨勢(shì)是促進(jìn)細(xì)胞增殖；另外，缺氧早期P13K通路被顯著激活，而TGF-β受體和Notch信號(hào)通路被抑制。由于抗凋亡基因(HSPA1A，ANXA1，C

10、FL1，HMOXl)表達(dá)明顯下調(diào)，促使缺氧早期凋亡發(fā)生；另有71個(gè)參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的基因表達(dá)發(fā)生改變，使細(xì)胞周期進(jìn)程受到影響；由于血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生潛能；由于ITGB1，ITGA6，THBS1，LAMB3，CD47，COL5A1，F(xiàn)NDC4，ITGA2，ITGA10黏附分子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)ECM受體相互作用；由于脂代謝相關(guān)基因ANGPTLA表達(dá)明顯上調(diào)，脂代謝加強(qiáng)，但ATP合成和

11、轉(zhuǎn)運(yùn)卻減少；雖然細(xì)胞對(duì)溫度反應(yīng)能力增強(qiáng)，但總體而言細(xì)胞對(duì)外界刺激反應(yīng)減弱，使臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)外界防御能力降低。 3．熒光定量PCR結(jié)果表明EA.hy926細(xì)胞缺氧處理3 h后，ANGPTL4、HNRPDLmRNA表達(dá)上調(diào)；FTH1，HMOX1，CTGF mRNA表達(dá)下調(diào)，其變化趨勢(shì)和SAGE文庫(kù)中豐度變化情況一致。 4．從SAGE文庫(kù)中挑選的3個(gè)無(wú)匹配標(biāo)簽通過(guò)GLGI均得到不同程度延伸，經(jīng)BLAST后與已知基因匹配，分別

12、是微管蛋白β2C、核糖體蛋白SA、核糖體蛋白L41。 5．據(jù)生物信息學(xué)分析對(duì)缺氧早期細(xì)胞增殖和凋亡改變的功能驗(yàn)證，證實(shí)缺氧早期此兩項(xiàng)細(xì)胞功能的改變與文庫(kù)生物信息學(xué)分析結(jié)果吻合。缺氧早期血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線左移，增殖指數(shù)于缺氧1 h即明顯升高，持續(xù)到缺氧6 h，缺氧12 h較正常對(duì)照下降；VEGF和PCNA表達(dá)均于缺氧早期升高，提示缺氧早期促進(jìn)細(xì)胞增殖。缺氧后3 h，12 h細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增高，提示缺氧早期促凋亡發(fā)生。

13、 6．缺氧后Integrin β1啟動(dòng)子活性明顯增強(qiáng)，其蛋白表達(dá)明顯增加；Integrin β1 RNA干擾可以明顯下調(diào)。Integrinβ1蛋白的表達(dá)，抑制EA.hy926細(xì)胞的增殖；缺氧處理后，，Integrin β1下調(diào)細(xì)胞株和正常EA.hy926細(xì)胞增殖曲線均發(fā)生明顯左移，但正常EA.hy926細(xì)胞生長(zhǎng)曲線左移程度較Integrin β1下調(diào)細(xì)胞株更大，兩者差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示缺氧早期通過(guò)上調(diào)Integrin β1表達(dá)，促進(jìn)

14、EA.hy926細(xì)胞的增殖。 三、結(jié)論 1．采用Long SAGE技術(shù)成功構(gòu)建了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞常氧和缺氧3 h Long SAGE文庫(kù)，獲得涵蓋上萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)錄本信息的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，鑒定出112個(gè)差異表達(dá)基因(P<0.05)。 2．缺氧早期以多種基因的激活或抑制方式，調(diào)節(jié)多種信號(hào)分子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、脂代謝、血管生成，有利于啟動(dòng)血管內(nèi)皮細(xì)胞自身保護(hù)性機(jī)制；同時(shí)細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期進(jìn)程受影響，細(xì)胞防御能力降低；文庫(kù)