1、心肌缺血性疾病仍是目前危害人類(lèi)健康的主要疾病,已有大量研究闡明了心肌缺血性疾病的主要病理特征,并開(kāi)發(fā)研制了一系列有效的治療藥物,目前傳統(tǒng)中藥在缺血性疾病治療中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。丹參作為傳統(tǒng)中藥,其多種中藥復(fù)合制劑如復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參注射液已廣泛應(yīng)用于臨床,但由于中藥復(fù)合制劑質(zhì)量的不穩(wěn)定和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不易控制等方面原因,很大程度上限制了中藥的發(fā)展,因此中藥有效成分單體的制備以及以天然活性成份為先導(dǎo)化合物的合成和半合成化學(xué)藥物及

2、成鹽衍生物,即中藥現(xiàn)代化,已成為現(xiàn)代中藥研究的主要方向。
　　 丹參素,化學(xué)名稱(chēng)為D-(+)β-(3,4-二羥基苯基)乳酸,是中藥丹參中的主要水溶性成份,也是丹參中唯一一種用于人類(lèi)臨床實(shí)驗(yàn)的有效單體。已有大量藥理實(shí)驗(yàn)證明丹參素有抑制血小板合成、聚集,提高抗氧化酶活性,減少氧自由基的產(chǎn)生,增加冠脈血流量,抑制細(xì)胞凋亡,減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載等藥理作用。目前丹參素的來(lái)源主要是中藥提取,由于丹參資源有限,中藥分離提取工藝復(fù)雜,并且丹參素結(jié)構(gòu)

3、中有兩個(gè)酚羥基的結(jié)構(gòu),極不穩(wěn)定,易被氧化,使提取效率很低,又由于丹參素是手性分子,其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)手性碳原子,用普通化學(xué)方法合成的均為外消旋體,關(guān)于消旋丹參素的化學(xué)合成方法已有一些報(bào)道,但是,由于丹參素結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)極易被氧化的酚羥基,不宜利用直接拆分的方法對(duì)丹參素外消旋體進(jìn)行手性拆分來(lái)獲得天然的右旋丹參素。因此,迄今為止,關(guān)于右旋丹參素及其衍生物的化學(xué)合成研究的報(bào)道非常少。
　　 丹參素中的兩個(gè)酚羥基被認(rèn)為是主要的活性基團(tuán),但也

4、有研究認(rèn)為苯基乳酸是其活性基團(tuán),參照這樣的構(gòu)效關(guān)系,本論文設(shè)計(jì)合成了幾種丹參素衍生物,1、用乙?；Ｗo(hù)兩個(gè)酚羥基,使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,通過(guò)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)獲得右旋丹參素衍生物38,期望分子中的乙酰基在體內(nèi)酯酶的作用下水解,釋放出活性基團(tuán)酚羥基。在合成過(guò)程中,在第二步的水解反應(yīng)中,改變反應(yīng)條件意外得到了具有兩個(gè)酚羥基的新化合物35。2、用亞甲基保護(hù)酚羥基,分子中的活潑氫用乙?；Ｗo(hù),有利于不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng),得到化合物44,分子中的乙?；隗w內(nèi)水解釋

5、放出苯基乳酸的結(jié)構(gòu)。3、參照硝酸甘油的設(shè)計(jì)理念,設(shè)計(jì)在分子中引入硝酸酯的結(jié)構(gòu),但在實(shí)際反應(yīng)中,硝基上到了苯環(huán)上,得到了兩個(gè)新結(jié)構(gòu)的硝基衍生物48、49。
　　 參照前人的研究結(jié)果,分別設(shè)計(jì)以3,4-二羥基苯甲醛和胡椒醛為原料,經(jīng)縮合、水解、對(duì)結(jié)構(gòu)中的活潑氫進(jìn)行保護(hù),不對(duì)稱(chēng)還原等步驟,成功獲得目標(biāo)化合物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共得到11個(gè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物,均經(jīng)波譜測(cè)定確證其結(jié)構(gòu)。在不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)中,目標(biāo)化合物38、44經(jīng)手性HPLC確定

6、其ee值分別為92％和98％,收率均大于89％。
　　 有文獻(xiàn)報(bào)道了迷迭香酸的硝基衍生物具有較好的抗HIV活性,因此對(duì)于化合物48、49,我們送抗HIV生物活性的檢測(cè),初步篩選結(jié)果顯示兩個(gè)化合物不具有抗HIV的活性,但這也可能與所檢測(cè)的抗HIV活性的靶點(diǎn)不同有關(guān)。
　　 通過(guò)建立原代心肌細(xì)胞缺氧模型,大鼠急性心肌梗死模型及慢性心衰模型,觀(guān)察目標(biāo)化合物38、44、35對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用,并初步探討了其保護(hù)作用的機(jī)制。

7、r>　　 1、丹參素衍生物對(duì)體外培養(yǎng)的缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用研究。
　　 培養(yǎng)原代大鼠心肌細(xì)胞,建立缺氧模型。分別用不同濃度(10-7,10-6,10-5,10-4mol/l)的38、44及其外消旋體39、46以及35處理細(xì)胞,用MTT的方法觀(guān)察丹參素衍生物對(duì)缺氧后細(xì)胞存活率的影響:檢測(cè)LDH漏出率觀(guān)察其對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用;檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量,觀(guān)察其抗氧化作用;用Hoechst染色的方法觀(guān)察其抗凋亡作用,并

8、用RT-PCR及Western blot的方法觀(guān)察丹參素衍生物對(duì)凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax及caspase-3的基因和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,五種化合物均能提高缺氧后細(xì)胞的存活率,降低LDH漏出率,顯示了較好的心肌細(xì)胞保護(hù)作用,其中化合物38的作用優(yōu)于其外消旋體39,化合物44與其外消旋體46的活性無(wú)顯著差異,五種化合物均能降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量,說(shuō)明其具有較好的抗氧化活性,Hoechst染色的結(jié)果顯示,化合物38、35具有較好的

9、抑制細(xì)胞凋亡的作用,并能上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),降低促凋亡基因Bax、easpase-3的表達(dá)。
　　 2、丹參素衍生物35對(duì)大鼠急性心肌梗死的保護(hù)作用研究。
　　 健康成年雄性SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、用藥組(15mg/kg,30mg/kg,60mg/kg),通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌梗死模型。手術(shù)前預(yù)給藥一周,每日腹腔注射一次,手術(shù)后繼續(xù)給藥兩天后,麻醉處死,取血及心臟組織。全血離心后取血漿,

10、檢測(cè)血漿中乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)的活性,超氧化物岐化酶(SOD)的活性及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量。心肌組織用于TTC染色,觀(guān)察丹參素衍生物對(duì)心肌梗死面積的影響。結(jié)果顯示,化合物35在三個(gè)不同濃度下均能降低血漿中心激酶的含量,升高SOD的活性,減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生,在60mg/kg的劑量時(shí),化合物35能顯著減小心肌梗死面積,表明化合物35對(duì)大鼠急性心肌梗死具有一定的保護(hù)作用。
　　 3、丹參素衍

11、生物35對(duì)大鼠慢性心衰的保護(hù)作用研究。
　　 參照文獻(xiàn)方法,大鼠急性心肌梗死模型后繼續(xù)喂養(yǎng)6周以制備心衰模型。健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和手術(shù)組,大鼠左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)后存活的大鼠再隨機(jī)分為模型組、用藥組(15mg/kg,30mg/kg,60mg/kg),手術(shù)后每日腹腔注射一次,共六周。所有動(dòng)物處死前從頸動(dòng)脈插管,連接多導(dǎo)生理記錄儀,記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):,進(jìn)行心功能的監(jiān)測(cè)左室收縮壓(LVSF),左室舒張末壓(LVEDP

12、)及左室壓力上升最大速率(dP/dt),動(dòng)物處死后取心臟稱(chēng)重,計(jì)算心/體重比。用RT-PCR和Western blot的方法檢測(cè)心肌組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的基因表達(dá);凋亡相關(guān)因子Bcl-2Baxcaspase-3caspase-9的基因和蛋白的表達(dá),及凋亡調(diào)節(jié)因子Akt及p-Akt的表達(dá);心室重構(gòu)的標(biāo)志物Ⅰ型膠原蛋白及TGF的表達(dá)。結(jié)果顯示,心肌梗死六周后,模型組大鼠的LVSP下降,LVEDP升高,dP/dt降低,用藥

13、組大鼠的心功能較模型組有好轉(zhuǎn),但只有在15mg/kg的劑量時(shí),其差異具有顯著性?；衔?5在15,30,60mg/kg三個(gè)劑量時(shí)均能顯著降低炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的基因表達(dá),以小劑量15mg/kg時(shí)效果最好;同時(shí)化合物35在三個(gè)劑量時(shí)能顯著降低促凋亡基因Bax、easpase-3及caspase-9的基因及蛋白表達(dá),升高抗凋亡基因Bel-2的基因及蛋白表達(dá),同時(shí)能促進(jìn)Akt的磷酸化,也是以小劑量時(shí)效果較好,表明其抗凋亡活性可

14、能是通過(guò)激活A(yù)kt通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子的表達(dá);但是,與預(yù)期結(jié)果不同,化合物35對(duì)Ⅰ型膠原蛋白及TGF的表達(dá)無(wú)顯著作用,這可能與所用動(dòng)物的樣本數(shù)量或者動(dòng)物的種類(lèi)有關(guān)。
　　 本論文設(shè)計(jì)了兩種右旋丹參素衍生物,通過(guò)不對(duì)稱(chēng)還原的方法以高ee值和高收率獲得了目標(biāo)化合物及其外消旋體,并在合成過(guò)程中意外獲得具有較好藥理活性的化合物35,初步藥理活性篩選結(jié)果顯示,兩種右旋丹參素衍生物及化合物35對(duì)缺血心肌均具有較好的保護(hù)作用,其機(jī)制可能