1、目的：構(gòu)建人乳頭瘤病毒16型:E7重組原核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)克隆、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,優(yōu)化蛋自表達(dá)的條件,經(jīng)Ni-NTA親和層法純化蛋自.利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)宮頸癌患者血清特異性抗體IgG,對(duì)重組蛋白作為特異性診斷抗原的可行性進(jìn)行評(píng)估,為HPV血清學(xué)診斷做準(zhǔn)備. 方法： 設(shè)計(jì)了能擴(kuò)增HPV16E7的PCR引物,從HPV16-DNA陽(yáng)性的宮頸癌組織中擴(kuò)增HPV16 E7全長(zhǎng)基因,并在兩端設(shè)計(jì)酶切

2、位點(diǎn).通過(guò)基因克隆方法將PCR產(chǎn)物片段定向插入到原核表達(dá)載體pET32a(+)多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒,并經(jīng)酶切和測(cè)序分析進(jìn)行鑒定.轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE<,3>),經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)的重組融合蛋白,用Ni-NTA親和層析法純化,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot,WB)分析鑒定.將純化獲得的HPV16E7重組蛋白作為抗原,酶聯(lián)免疫吸

3、附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)20份HPV16陽(yáng)性宮頸癌病人血清中特異性抗體IgG,并選擇60份兒童血清及58份尖銳濕疣病人血清作為對(duì)照:正常兒童組血清均值用以確定cutoff值. 結(jié)果： 經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)/HPV16E7,IPTG誘導(dǎo)下HPV16 E7融合蛋白以可溶形式得到較好的表達(dá),目的蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白的16﹪,SDS-PAGE電泳分析重組E7蛋白與表達(dá)載體的標(biāo)簽蛋白形成相

4、對(duì)分子質(zhì)量約30kDa,與預(yù)期相符.Western Blot結(jié)果顯示與His.Tag單克隆抗體良好的免疫反應(yīng)性,Ni-NTA親和層析法進(jìn)行蛋白純化,純度達(dá)95﹪.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)結(jié)果:20份宮頸癌血清標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)9例陽(yáng)性,陽(yáng)性率約45﹪(9/20),CA組中發(fā)現(xiàn)2例陽(yáng)性,陽(yáng)性率約3.4﹪(2/58),兒童對(duì)照組中未見陽(yáng)性反應(yīng). 結(jié)論： 成功構(gòu)建了pET32a(+)/HPV16E7重組原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)及純化H