1、動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是危害人類健康的主要疾病之一。對(duì)AS防治藥物的研究一直是基礎(chǔ)和臨床研究的重要課題。高脂血癥被認(rèn)為是AS的高危因子之一，其中氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density Lipoprotein，ox-LDL）是致AS發(fā)生的始動(dòng)因素，它通過脂質(zhì)過氧化作用導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損、分泌多種細(xì)胞活性因子和生長因子，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、單核細(xì)胞粘附、血小板聚集和泡沫細(xì)胞形成，最終導(dǎo)致粥樣

2、斑塊形成。因此，抑制ox-LDL的生成或降低ox-LDL對(duì)機(jī)體的損傷是預(yù)防AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。
　　 現(xiàn)今臨床主要應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACE-I）、β-受體阻滯劑、降脂藥、超氧化物歧化酶（SOD）等藥物治療，以試圖改善患者受損的內(nèi)皮功能。但其治療存在兩個(gè)主要問題：1、阻斷正常生理功能運(yùn)行所需的物質(zhì)；2、大部分藥物對(duì)肝臟、腎臟有毒副作用。西方現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AS是屬于病因未明的疾病，最好采用緩解和抑制癥狀為主的醫(yī)療策略。中藥

3、作為人類維護(hù)健康體系的一個(gè)重要組成部分，大多數(shù)是天然藥物，符合“返璞歸真”、“回歸自然”的潮流，與生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式相適應(yīng)。中國藥典記載，車前子為車前科（Plantaginceae）植物車前的干燥成熟種子?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明車前子不僅具有清腸通便、降低血脂、調(diào)節(jié)血糖、免疫調(diào)節(jié)的功效，還能抑制脂質(zhì)過氧化物及自由基的產(chǎn)生，并對(duì)動(dòng)脈血管壁的重構(gòu)有重要作用。但是否能改善內(nèi)皮功能損傷尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)采用現(xiàn)代技術(shù)手段從車前子中提取得到有效成分

4、車前子多糖（plantain seed polysaccharide，PSP），通過ox-LDL對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞體外直接損傷，探討PSP對(duì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為AS的防治提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
　　 一人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定
　　 目的：建立簡單有效且重復(fù)性高的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）體外原代及傳代培養(yǎng)技術(shù)

5、，并對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究內(nèi)皮細(xì)胞功能提供重要的實(shí)驗(yàn)方法。
　　 方法：（1）配制培養(yǎng)液：分別配制含10％和20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，然后加入終濃度為15 ng/ml VEGF、100U/ml青、鏈霉素，用前調(diào)節(jié)pH值7.0～7.2。（2）HUVECs的原代分離培養(yǎng)：取臍帶（大于20 cm），采用Ⅰ型膠原酶灌注消化法在臍靜脈中分離內(nèi)皮細(xì)胞，用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。（3）HUVECs的傳代培養(yǎng)：原

6、代分離的HUVECs生長匯合至80％后，胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。（4） HUVECs的鑒定：①倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁及生長情況；②人第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體免疫組化檢測。
　　 結(jié)果：（1） HUVECs生長情況及形態(tài)學(xué)變化：①生長時(shí)間：原代分離的內(nèi)皮細(xì)胞2h左右開始貼壁生長，細(xì)胞為扁平多角形，24h完全貼壁，變成梭形，7～10d細(xì)胞融合成單層；傳代細(xì)胞分布較均勻，0.5h左右開始貼壁生

7、長，3～5d長成單層，細(xì)胞匯合成典型的鋪路石狀。②細(xì)胞形態(tài)：原代培養(yǎng)時(shí)，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈小三角形、圓形，多數(shù)細(xì)胞聚集成團(tuán)。生長活躍期細(xì)胞，呈橢圓形或圓形，邊界清楚、胞質(zhì)豐富，內(nèi)含小顆粒。傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞生長快，細(xì)胞密集，分散均勻，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈短梭形或多角形，胞核變圓，呈鋪路石狀排列，細(xì)胞周圍近胞核處可見明顯光暈，為典型的內(nèi)皮細(xì)胞生長特點(diǎn)，可以確定所培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 （2）第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體免疫組化

8、檢測：細(xì)胞呈圓形、橢圓形或梭形，胞漿豐富，胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色的染色顆粒，細(xì)胞核不著色，呈陽性反應(yīng)；而對(duì)照組（加PBS液）胞質(zhì)內(nèi)無棕黃色的染色顆粒，呈陰性反應(yīng)，可進(jìn)一步確認(rèn)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 結(jié)論：血管內(nèi)皮細(xì)胞可從胎兒臍帶中利用0.1％Ⅰ型膠原酶灌注，在37℃水平搖床上消化10min的方法分離獲得，并且通過原代和傳代培養(yǎng)成為細(xì)胞系，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞周圍近胞核處可見明顯光暈，為典型的內(nèi)皮細(xì)胞生長特點(diǎn)，可以確定為內(nèi)皮

9、細(xì)胞；并利用人第Ⅷ因子抗原抗體免疫組化法檢測，進(jìn)一步鑒定證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。二車前子多糖對(duì)氧化型低密度脂蛋白致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　 目的：利用ox-LDL對(duì)培養(yǎng)的HUVECs造成脂質(zhì)過氧化損傷，觀察PSP對(duì)其保護(hù)作用和探討其可能的機(jī)制。
　　 方法：用MTT方法和化學(xué)方法從細(xì)胞水平觀察ox-LDL對(duì)細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞上清液中一氧化氮（NO）含量和細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）活性以及丙二醛（MDA

10、）含量、SOD活力；用ELISA法和RT-PCR方法從分子水平觀察ICAM-1和凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。觀察不同濃度的PSP（25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L）對(duì)上述指標(biāo)的影響。
　　 結(jié)果：（1）對(duì)細(xì)胞增殖率的影響：在ox-LDL損傷的條件下，細(xì)胞增殖率與空白對(duì)照組相比明顯下降（P<0.01），低濃度的PSP組細(xì)胞增殖率為（9.65±0.89）％，與ox-LDL損傷組相比有顯著性差異（P<0.05）；中、高

11、濃度的PSP組細(xì)胞增殖率分別為（39.03±3.35）％、（54.78±4.03）％，與ox-LDL損傷組相比有明顯差異（P<0.01），且有一定的劑量依賴性。
　　 （2）對(duì)MDA含量的影響：空白對(duì)照組MDA含量為1.31±0.39 nmol/ml，在ox-LDL損傷的條件下，MDA含量為5.07±0.78 nmol/ml，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.01）；用不同濃度的PSP處理后MDA含量分別為4.61±0.70

12、、2.83±0.48、1.29±0.31 nmol/ml，與ox-LDL損傷組相比差別顯著（P<0.05），且有一定的劑量依賴性，說明PSP具有一定的抗氧化作用。
　　 （3）對(duì)SOD活力的影響：空白對(duì)照組SOD活力為21.65±1.89 U/ml，ox-LDL損傷組SOD活力為13.97±0.97U/ml，不同濃度的PSP組SOD活力分別為15.76±1.13、18.58±1.64、20.92±1.78 U/ml，可見不同濃度

13、的PSP組的SOD活力均高于ox-LDL損傷組（P<0.05），并無明顯的劑量依賴性。
　　 （4）對(duì)NO含量的影響：PSP可明顯提高NO的釋放，并有一定的劑量依賴性，空白對(duì)照組NO含量為69.73±3.35μmol/L，ox-LDL損傷組NO含量為31.71±1.91μmol/L，低濃度的PSP組NO含量為46.41±2.25μmaol/L，與ox-LDL損傷組相比有顯著性差異（P<0.05）；中、高濃度的PSP組中NO含量分

14、別為57.68±3.03、65.51±3.12μmol/L，與ox-LDL損傷組相比有顯著性差異（P<0.01）。
　　 （5）對(duì)NOS活性的影響：空白對(duì)照組NOS活性為0.99±0.09 U/mgprot，ox-LDL損傷組NOS活性為0.31±0.02U/mgprot，低濃度的腳組NOS活性提高，其活性為0.55±0.06U/mgprot，與ox-LDL損傷組相比有顯著性差異（P<0.05）；中、高濃度的PSP組的NOS活性

15、明顯提高，其活性分別為0.71±0.07、0.98±0.10 U/mgprot，與ox-LDL損傷組相比均有顯著性差異（P<0.01），并呈一定的劑量依賴性。
　　 （6）對(duì)ICAM-1表達(dá)的影響：空白對(duì)照組ICAM-1的表達(dá)量為4.35±0.64 pg/ml，ox-LDL損傷組ICAM-1表達(dá)量為5.23±0.78 pg/ml，不同濃度的PSP組ICAM-1的表達(dá)量分別為：5.13±0.58、4.28±0.31、4.36±0.

16、52 pg/ml，與ox-LDL損傷組相比有顯著性差異（P<0.05），但無明顯的劑量依賴性。
　　 （7） RT-PCR檢測結(jié)果：PSP可下調(diào)ox-LDL致內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)凋亡相關(guān)基因c-myc、P53的mRNA水平，且有一定的劑量依賴性。空白對(duì)照組、ox-LDL損傷組、低、中、高三個(gè)濃度的PSP組c-myc的相對(duì)表達(dá)量分別為0.2029±0.0225、0.3094±0.0572、0.2837±0.0482、0.2792±0.0

17、457、0.2705±0.0323，P53的相對(duì)表達(dá)量分別為O.1839±0.0122、0.2841±0.0203、0.2594±0.0371、0.2278±0.0197、0.2189±0.0210，可見，不同濃度的PSP組與ox-LDL損傷組比較凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平均有顯著性差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：（1） PSP通過穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使內(nèi)皮細(xì)胞免受自由基的損害，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成，提高細(xì)胞SOD的活力；