1、目的：
　　 1. 歸納并探索抗精子抗體陽性大鼠模型建立的方法，為抗精子抗體相關大鼠試驗研究積累數(shù)據(jù)及經(jīng)驗方法。
　　 2. 考察血清抗精子抗體和精液抗精子抗體對精子凋亡影響的差異，應用Annexin V/PI染色聯(lián)合流式細胞儀分析抗精子抗體與精子凋亡的關系，為免疫性不育的病因研究積累資。
　　 3. 應用JC-1染色聯(lián)合流式細胞儀、電鏡、western blot以及分光光度法分析凋亡精子中線粒體跨膜電位和超微結

2、構、細胞色素c的釋放以及caspase-3活性的變化，為抗精子抗體致精子凋亡的途徑研究提供證據(jù)。
　　 方法：
　　 1. 建立抗精子抗體陽性SD大鼠動物模型：取雄性SD大鼠40只，動物等級SPF，體質(zhì)量200～230g，恒溫條件下飼養(yǎng)，自由進水、進食。將大鼠隨機分為2組：實驗組30只、對照組10只。采用同種精子及福氏免疫佐劑對實驗組大鼠進行免疫。對照組注射生理鹽水。每隔7日重復。建模周期為21～35天。
　　

3、2. 采用電射精技術取大鼠精液：自備電射精儀。管狀鼠籠固定大鼠，剪去背上腰部至骼部區(qū)域的毛，生理鹽水擦凈并潤濕皮膚。將3×3cm的銅片電極固定在剪毛區(qū)域，接電射精儀的輔助電極。桿狀電極輕輕插入大鼠肛門內(nèi)約至2～3cm，接電射精儀的刺激電極。接通電源。每只大鼠平均刺激3至7次就可射精。
　　 3. ELISA法檢測兩組大鼠血清、精液抗精子抗體：采集大鼠精液及眼眶血標本后按照elisa試劑盒說明書步驟進行。血清、精液抗精子抗體俱為陽

4、.性證明局部模型建立成功，為精液組。血清抗精子抗體陽性證明循環(huán)模型建立成功，為血清組。
　　 4. Annexin V/PI染色結合流式細胞技術檢測三組大鼠精子的凋亡率。制備三組大鼠精子標后，將精子標本用精子孵育緩沖液制成（3～6）×106個/ml的懸液，取195ul精子懸液，加入5ul Annexin V（0.2mg/ml）染液。室溫避光孵育10min，離心（200×g， 5min），PBS重懸洗滌3次后再次重懸于190ul

5、PBS。加入PI（0.1mg/ml）染液10ul。室溫避光孵育20min后，上流式細胞儀檢測。激發(fā)波長488nm，分別以紅色熒光和綠色熒光檢測細胞。每份精子懸液標本獲取10000個細胞。經(jīng)CellQuest軟件分析得正常細胞、早期凋亡、晚期凋亡、死亡細胞所占的比例。
　　 5. JC-1單標法流式細胞術檢測三組大鼠精子線粒體膜電位變化。將精液標本用PBS洗滌2次后離心。PBS重懸并調(diào)整精子密度為1×106/ml。加入終濃度為5μ

6、g/ml的JC-1，37℃恒溫箱避光溫育10min，PBS洗滌除去游離的多余染料后，PBS重懸，即刻上流式細胞儀檢測。激發(fā)波長488nm，應用前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC）設門后，通過熒光通道FL1（綠）和FL2（紅）檢測熒光強度，每份精子懸液標本獲取10000個細胞。應用CellQuest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，用發(fā)橙紅色熒光精子百分率表示MMP正常精子的比例。
　　 6. Western blot檢測三組大鼠精子內(nèi)細

7、胞色素c的釋放：精子標本于玻璃勻漿器中冰浴勻漿，采取分級差速離心法將細胞核與線粒體逐級分離出來，收集為胞質(zhì)蛋白樣品和線粒體蛋白樣品。分別測定蛋白含量后加入上樣緩沖液，加熱變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，裁膠，半干轉膜法轉膜，封閉。分別加一抗或內(nèi)參抗體，孵育過夜。加相應辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育1h，ECL檢測，拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度值分析。
　　 7. 分光光度法檢測caspa

8、se-3活性：收集三組大鼠精子后按試劑盒說明書步驟進行caspase-3活性分析，酶標儀讀數(shù)。
　　 8. 透射電鏡觀察實驗組大鼠精子線粒體超微結構變化。取大鼠精子標本后，離心，固定。交電鏡室處理切片后，透射電鏡下觀察線粒體超微結構。
　　 9. 光學顯微鏡下觀察三組大鼠附睪內(nèi)組織結構變化。取三組大鼠附睪，交病理科處理切片后，于光學顯微鏡下觀察其組織結構。
　　 10. 統(tǒng)計學分析方法：所有統(tǒng)計學分析都應用SAS

9、統(tǒng)計軟件。40只SD大鼠分為精液組、血清組、對照組，對其精子凋亡率、精子線粒體跨膜電位、cgspase-3活性值、細胞色素c蛋白灰度值分別行統(tǒng)計學分析，分別采用卡方分析和單因素方差分析，計量資料用（x±s），組間比較用S-N-K法和LSD法。
　　 結果：
　　 1. 抗精子抗體檢測結果。按照試劑盒所定標準，抗精子抗體值高于60U/ml為陽性。實驗組30只SD大鼠均為血清抗精子抗體陽性，抗體值為（79.8±7.1）U/m

10、l，其中12只為血清、精液抗精子抗體陽性，精液抗體值為（76.7±6.6）U/ml，血清抗體值為（81.5±7.7）U/ml，剩余18只為精液抗精子抗體陰性，血清抗精子抗體陽性，抗體值為（78.1±7.5）U/ml。對照組為陰性。
　　 2. Annexin V/PI染色結合流式細胞技術檢測凋亡結果。精液組、血清組和對照組精子凋亡率分別為（35.88±6.49）％、（14.30±2.30）％和（12.38±2.56）％。其中血清

11、組與對照組凋亡率組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。精液組與對照組凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。精液組與血清組凋亡率組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
　　 3. JC-1單標法流式細胞術檢測精子線粒體跨膜電位結果。精液組發(fā)橙紅色熒光精子百分率為（40.25±9.50）％，血清組為（80.87±14.15）％，對照組為（81.56±12.78）％。其中精液組與對照組組間差異有統(tǒng)計學意義（P

12、<0.00 1）；精液組與血清組組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；血清組與對照組組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 4. Western blot檢測線粒體細胞色素c的釋放結果。胞漿細胞色素c與內(nèi)參灰度比值：精液組與血清組、精液組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；血清組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。線粒體細胞色素c與內(nèi)參灰度比值：精液組與血清組、精液組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；

13、血清組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。說明在AsAb作用下精液組精子線粒體內(nèi)的細胞色素c發(fā)生了位置轉移，從線粒體釋放到了胞漿中。血清AsAb則對細胞色素c的釋放沒有影響。
　　 5. 分光光度法檢測精子內(nèi)caspase-3活性的結果：精液組與血清組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；精液組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；血清組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。說明AsAb作用于精子可導致精子Caspas

14、e 3活性的上升，但血清AsAb則無影響。
　　 6. 透射電鏡觀察線粒體超微結構結果。精液組精子線粒體大小不一，分布不均，有明顯的腫脹，部分出現(xiàn)畸形或巨型線粒體，呈空泡狀，線粒體嵴模糊甚至缺失。血清及對照組超微結構正常。
　　 7. 光學顯微鏡下觀察三組大鼠附睪組織結構可見精液組大鼠附睪，上皮細胞增生，間質(zhì)細胞水腫，管腔狹窄，且管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少。血清及對照組正常。
　　 結論：
　　 1. 本實驗

15、采用的同種異體精子加福氏免疫佐劑對大鼠進行免疫的建模方法成功率高，周期短，且可建立精液抗精子抗體陽性模型，可為建立抗精子抗體大鼠模型的簡便可靠方法。
　　 2. 精液抗精子抗體可誘導精子凋亡，血清抗精子抗體對精子凋亡無影響，可為抗精子抗體介導的免疫性不育病因研究提供重要參考。
　　 3. 精液抗精子抗體可導致精子線粒體跨膜電位下降、線粒體細胞色素c釋放、caspase-3活性上升、線粒體超微結構發(fā)生病理改變以及附睪組織病