1、前言:
　　 骨肉瘤是種好發(fā)于兒童及青少年的骨原發(fā)性惡性腫瘤。它常發(fā)生肺轉移,且預后較差。當前,手術結合化療是骨肉瘤治療的主要方式。然而,令人遺憾的是手術并不能阻止遠處轉移。因此,化療在骨肉瘤的治療中占有極其重要的地位。自從上個世紀70年代末,新輔助化療的提出及廣泛實施,使非轉移性骨肉瘤的預后有了很大改進,如今5年生存率可達到70％左右。但近30多年來,骨肉瘤化療的主導藥物仍是順鉑、阿霉素及大劑量的甲氨蝶呤,它們雖對骨肉瘤有著較

2、高的有效率,但往往也存在較大的毒副反應,如耳毒性、腎毒性、骨髓抑制等。此外,骨肉瘤還容易對這些常規(guī)化療藥物產(chǎn)生耐藥性而導致化療失敗。因此,尋找新的有效的化療藥物對骨肉瘤治療將有著重大的意義。
　　 氯化兩面針堿(nitidine chloride,NC)是從蕓香科花椒屬植物兩面針Zanthoxylum nitidum的干燥根中提取的一種苯菲啶類生物堿。兩面針作為一種傳統(tǒng)中藥材,在我國的西南部地區(qū)有著廣泛分布,其提取物主要用來抗炎

3、、陣痛、解痙等。氯化兩面針堿作為兩面針的主要活性成分,近年來,有研究報道它具有一定的抗腫瘤活性。在一些體外實驗中,它可明顯抑制人肺癌細胞、人舌癌細胞、人口腔鱗癌細胞等。然而,其對骨肉瘤細胞的作用尚未見報道。本研究,以人骨肉瘤細胞株MG-63為對象,來探討氯化兩面針堿對其增殖抑制作用及其相關機制。
　　 目的:
　　 觀察氯化兩面針堿對人骨肉瘤MG-63細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用,并進一步探討其抗骨肉瘤作用的相關分子機制

4、。
　　 方法:
　　 采用MTT法于體外觀察不同濃度的氯化兩面針堿(0、0.25、0.5、1、2、4、8μmol/L)作用于人骨肉瘤MG-63細胞24、48、72小時后,其對細胞的生長抑制作用,并計算各時間點相應的半數(shù)有效抑制濃度(IC50值)。在普通倒置相差光鏡下、熒光顯微鏡下及透射電鏡下觀察不同濃度的氯化兩面針堿對MG-63細胞形態(tài)的影響及誘導凋亡的作用;使用Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測不同濃度

5、的氯化兩面針堿作用于MG-63細胞48小時后各自的凋亡率;并采用流式細胞術分析不同濃度的氯化兩面針堿處理MG-63細胞48小時后細胞周期的分布;通過WesternBlot法檢測不同濃度的氯化兩面針堿作用于MG-63細胞48小時后,其細胞內(nèi)caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、cdc2、cdc25c、cyclin B1和survivin蛋白的表達差異,以探討其可能的分子機制。
　　 統(tǒng)計學分析用SPSS16.

6、0統(tǒng)計軟件完成,計量資料數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示,組間比較采用非獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計學意義。P＜0.01表示為差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 MTT結果表明,氯化兩面針堿能明顯抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖,且呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性。0.5μmol/L以上的氯化兩面針堿作用于MG-63細胞48小時以后,與對照組(0μmol/L)相比,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.

7、01)。氯化兩面針堿作用于MG-63細胞24、48、72小時的IC50值分別為8.29、2.80和1.34μmol/L。
　　 普通光鏡下,可發(fā)現(xiàn)隨著氯化兩面針堿濃度的增高,MG-63細胞的生長密度逐漸降低,漂浮脫落的細胞逐漸增多。經(jīng)Hoechst33258染色后,于熒光顯微鏡下觀察,可發(fā)現(xiàn)對照組細胞核呈現(xiàn)隱約的淺綠色熒光,并大小均勻一致。而隨著氯化兩面針堿濃度的增高,凋亡的細胞逐漸增多,表現(xiàn)為細胞核大小不一,顯色較為清亮,有的

8、細胞核發(fā)生碎裂,裂解成幾個濃縮的極亮的藍色熒光顆粒等。此外,透射電鏡下,經(jīng)氯化兩面針堿處理過的MG-63細胞仍可看到不同程度的凋亡特征,表現(xiàn)為細胞核染色質濃縮、邊集,胞質內(nèi)有大量空泡,細胞表面微絨毛減少等。
　　 Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測結果表明,氯化兩面針堿可誘導MG-63細胞凋亡,其凋亡率呈明顯的濃度依賴性。0、0.5、1、2μmol/L的氯化兩面針堿處理MG-63細胞48小時后相應的早期凋亡率分別為

9、2.82％、8.37％、23.75％、49.96％。
　　 細胞周期檢測結果顯示,氯化兩面針堿能使MG-63細胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯,隨著藥物濃度的增高,絕大多數(shù)的腫瘤細胞處在G2/M期,同時,處在S期的腫瘤細胞逐漸減少。
　　 Western Blot結果表明,隨氯化兩面針堿濃度的增高,MG-63細胞中Bax的表達依次增高,Bcl-2、cdc2、cdc25e、cyclin B1和survivin的表達依次降低,并且