1、本課題擬以新生隱球菌侵襲血管內(nèi)皮細(xì)胞模型為研究對象，采用二維凝膠電泳及生物質(zhì)譜技術(shù)，分析研究血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)改變譜，選出在這一過程中可能起重要作用的部分蛋白質(zhì)，同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)分析這些蛋白質(zhì)的mRNA在侵襲過程中不同階段的轉(zhuǎn)錄情況，尋找在這一過程中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)分子。 研究內(nèi)容和方法： 建立新生隱球菌侵襲血管內(nèi)皮細(xì)胞模型并篩選相應(yīng)菌株：選取原代培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，培養(yǎng)擴(kuò)增至所需數(shù)量。

2、選取新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)野生株B3501、莢膜缺陷株Cap60和白化株Mel-這3種新生隱球菌，活化培養(yǎng)后制成菌懸液，加入血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，分別共孵育30min，1h，2h，3h，4h，5h。通過CCK-8法及流式細(xì)胞儀對血管內(nèi)皮細(xì)胞孵育不同時(shí)段活性的檢測，探索出新生隱球菌與血管內(nèi)皮細(xì)胞孵育的適合時(shí)間，并確定以新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)野生株B3501作為下一步實(shí)驗(yàn)中所采用的菌株。 篩選與新生隱球菌孵育后血管內(nèi)皮細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜：利用2-

3、D凝膠電泳技術(shù)對正常HUVEC細(xì)胞和與新生隱球菌B350l共孵育4小時(shí)后的HUVEC總蛋白進(jìn)行電泳分離，獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)譜。ImageMaster Platinum5.0圖形分析軟件對凝膠圖譜進(jìn)行分析，篩選出正常細(xì)胞與孵育后細(xì)胞間的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。選取部分差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，利用MALDI-TOF MS對蛋白點(diǎn)進(jìn)行肽指紋譜(PMF)鑒定。 部分蛋白在新生隱球菌侵襲血管內(nèi)皮細(xì)胞不同階段的表達(dá)變化情況：從正常細(xì)胞與癌變細(xì)胞差異表達(dá)蛋白譜中選

4、取s100A10、Prx Ⅰ作為代表，利用熒光定量PCR技術(shù)觀察這兩種蛋白在正常細(xì)胞和與新生隱球菌共孵育1、2、4小時(shí)后的HUVEC中mRNA拷貝數(shù)的變化情況，對這2種蛋白在新生隱球菌侵襲血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用進(jìn)行推測和討論。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 不同新生隱球菌菌株對HUVEC的抑制率有著不同程度的影響，這可能與不同菌株的毒力因子發(fā)揮作用的機(jī)制不同有關(guān)。三種菌株在共孵時(shí)間為30min時(shí)，三者對HUVEC的抑制率相差不大，分別為40

5、％，41％和40％，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異。莢膜缺陷株Cap60對HUVEC的抑制率在1h達(dá)到最高峰79％：白化株Mel-對HUVEC的抑制率在3h到最高峰77％。莢膜缺陷株Cap60對HUVEC的抑制率最高，可以達(dá)到79％，且達(dá)到最高點(diǎn)所需時(shí)間最短，在1h達(dá)到最高點(diǎn)；白化株Mel-達(dá)到最高峰需要的時(shí)間略長，在3h時(shí)抑制率達(dá)到77％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生株B3501。野生株B3501對HUVEC的抑制率隨時(shí)間延長無明顯變化，抑制率變化趨勢比較平穩(wěn)，

6、孵育4小時(shí)后，HUVEC沒有出現(xiàn)大量死亡。因此選取野生株B3501作為下一步實(shí)驗(yàn)的菌株，并以孵育4小時(shí)作為孵育條件。 雙向凝膠電泳分析正常HUVEC細(xì)胞和與新生隱球菌B3501孵育4小時(shí)HUVEC細(xì)胞總蛋白，孵育組即實(shí)驗(yàn)組凝膠最后共得到921±33個(gè)蛋白點(diǎn)，正常細(xì)胞組即對照組最后共得到1025±38個(gè)蛋白點(diǎn)。3次電泳結(jié)果重復(fù)性良好，所有凝膠圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)分布模式非常相似。實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，共得到791個(gè)匹配蛋白點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組與對照

7、組的點(diǎn)匹配率分別為77.17％和85.88％。 經(jīng)過比對，實(shí)驗(yàn)組凝膠與對照組凝膠共找到可信差異表達(dá)蛋白點(diǎn)19個(gè)。其中有5個(gè)蛋白點(diǎn)僅在對照組細(xì)胞中表達(dá)，3個(gè)蛋白點(diǎn)僅在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)，另有10個(gè)蛋白點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)降低，1個(gè)在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)升高。 對所有僅在一組細(xì)胞中表達(dá)的的蛋白點(diǎn)和部分差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)利用MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行了PMF(肽指紋譜)鑒定，最后共有15個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定。在得到鑒定的蛋白質(zhì)點(diǎn)

8、中，Prohibitin和Heat-shock protein beta-1僅在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)，peroxiredoxin 1等蛋白僅在對照組中表達(dá)，S100A10在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)增加，超氧化物歧化酶等蛋白在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下降。有許多研究表明這些蛋白參與了細(xì)胞的代謝、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)動(dòng)等生理功能。 熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)： (1)S100A10的mRNA拷貝數(shù)在正常細(xì)胞組、孵育1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)組中逐漸上升，除去正常細(xì)胞組和孵育

9、1小時(shí)組之間無明顯差異(P>0.05)外，其余各組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。(2)Prx Ⅰ的mRNA拷貝數(shù)在正常細(xì)胞組、孵育1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)組中逐漸下降，下降速度快，各組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。孵育4小時(shí)組中Prx Ⅰ的轉(zhuǎn)錄幾乎被完全抑制。 討論： 新生隱球菌入侵人體是一個(gè)復(fù)雜的過程，血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的屏障是其入侵機(jī)體乃至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最初的也是最關(guān)鍵的一道屏障。因此，了解新生隱球菌和血管

10、內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，對于揭開其感染機(jī)制可能具有重要的意義。由于蛋白質(zhì)是基因的最終產(chǎn)物和最終執(zhí)行者，一切疾病的發(fā)病都和蛋白質(zhì)數(shù)量和功能的改變有關(guān)，因此從蛋白質(zhì)層面研究兩者的相互作用可能更為直接。二維凝膠電泳具有快速、并行、高通量的特點(diǎn)，具有高靈敏度和高分辨率，可以很好地與質(zhì)譜分析相匹配，能夠同時(shí)對全基因組水平的大量蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選和研究。在本研究中，建立了新生隱球菌和人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的模型，利用二維凝膠電泳對新生隱球菌孵育后的H

11、UVEC總蛋白質(zhì)與正常HLNEC總蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離鑒定，初步鑒定出13個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)。這些蛋白參與了細(xì)胞的代謝、增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)動(dòng)等生理功能，提示這些蛋白表達(dá)的改變可能是新生隱球菌影響HIJVEC功能的手段。 縱觀以上蛋白，可以發(fā)現(xiàn)這些蛋白的功能主要集中在三個(gè)方面，一是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，二是參與細(xì)胞骨架，三是參與細(xì)胞代謝。蛋白S100A10(Calpactin Ⅰlight chain)，依鈣蛋白Ⅰ輕鏈，又稱p11蛋白、S10

12、0A10蛋白，屬于鈣結(jié)合蛋白家族中的S100蛋白家族。S100蛋白家族分子量在10～12kD，其氨基酸序列高度保守，與其他鈣離子結(jié)合蛋白具有高度同源性。S100蛋白的兩個(gè)亞基與鈣離子結(jié)合后，與靶蛋白結(jié)合從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，其功能與細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞骨架、細(xì)胞遷移等有關(guān)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要意義。S100A10蛋白的靶蛋白是S100蛋白家族的另一成員膜聯(lián)蛋白Ⅱ(annexinⅡ、依鈣蛋白Ⅰ重鏈)，兩者形成一緊密的四

13、聚體膜聯(lián)復(fù)合物，它們形成的復(fù)合物有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，可對肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的活動(dòng)產(chǎn)生明顯的影響。而肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架支持著細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)如胞吞、胞吐、定向生長、黏附、遷移等。有研究顯示，annexin Ⅱ與巨噬細(xì)胞的吞噬功能及細(xì)胞分泌功能均有關(guān)系。敲除annexinⅡ的表達(dá)可減少神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。這些都說明S100A10的表達(dá)增高，可能對細(xì)胞遷移及胞吐作用、內(nèi)吞作用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中S100A10蛋白表達(dá)增加，表明HUV

14、EC細(xì)胞骨架活動(dòng)可能增加，細(xì)胞的遷移、胞吞、胞吐等活動(dòng)有可能增強(qiáng)。推測HUVEC出現(xiàn)上述現(xiàn)象對于新生隱球菌穿越血管屏障是有利的，也可能是新生隱球菌通過血管內(nèi)皮細(xì)胞層的機(jī)制之一。推測新生隱球菌可能增強(qiáng)HUVEC胞吞、胞吐等活動(dòng)，先被HUVEC吞噬，然后從內(nèi)皮細(xì)胞的另一側(cè)被釋放，從而穿越了血管屏障。 Peroxiredoxin(Prx)是新發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶，其催化活性和蛋白序列與其他抗氧化劑完全不同，廣泛存在于原核生物和真核生物中。在哺

15、乳動(dòng)物中，Prx蛋白家族包括6個(gè)成員，Prx Ⅰ-Ⅵ，其生化功能是通過硫氧還蛋白利用谷胱甘肽作為還原劑，還原、消除代謝產(chǎn)生過氧化物或超氧化物。Prx Ⅰ定位于細(xì)胞質(zhì)中，是一個(gè)可誘導(dǎo)的蛋白，在氧化應(yīng)激條件下其表達(dá)顯著增高。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化增加peroxiredoxin基因的表達(dá)，可保護(hù)細(xì)胞膜免受磷脂過氧化物介導(dǎo)的膜損傷，使小鼠肺免于高氧損傷，并使小鼠在高氧條件下的生存時(shí)間延長。 以上這些蛋白與Prx Ⅰ、S100A1

16、0相互印證，進(jìn)一步提示，新生隱球菌和HUVEC作用后可能通過以下幾個(gè)方面影響HUVEC的正常生理功能： 一、減少HUVEC對氧應(yīng)激的耐受能力，細(xì)胞損傷增加，增殖能力下降。 二、增強(qiáng)細(xì)胞骨架活動(dòng)能力，促進(jìn)細(xì)胞胞吞胞吐活動(dòng)。S100A10與靶蛋白形成的復(fù)合物可能增強(qiáng)細(xì)胞骨架活動(dòng)，加強(qiáng)胞吞胞吐活動(dòng)，新生隱球菌可能通過先被吞噬，穿過細(xì)胞后被釋放的方式穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障。另外Prohibitin增高也可能促進(jìn)了細(xì)胞骨架的活動(dòng)。

17、 三、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。HSP27和PSA7等可能與細(xì)胞凋亡過程有關(guān)，促進(jìn)了HUVEC細(xì)胞凋亡。 四、影響了HUVEC正常的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。Prx Ⅰ、S100A10和CacyBP等蛋白都參與了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，細(xì)胞的正常生理功能也受到了影響。 五、抑制細(xì)胞能量代謝。AK4、蘋果酸脫氫酶的表達(dá)下降可能使細(xì)胞能量代謝受到抑制，細(xì)胞ATP水平下降，導(dǎo)致細(xì)胞生理活動(dòng)減弱，細(xì)胞功能紊亂。 以上五個(gè)方面的作用，使

18、得HUVEC凋亡增加，增殖減少，從而破壞了血管內(nèi)皮細(xì)胞層的完整，進(jìn)而破壞血管屏障功能的健全，為新生隱球菌穿越血管屏障創(chuàng)造良好的條件。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞總體生理功能下降的同時(shí)，細(xì)胞的細(xì)胞骨架活動(dòng)卻得到了增強(qiáng)，因此推測新生隱球菌能促進(jìn)HUVEC的細(xì)胞骨架功能，加強(qiáng)其吞噬和胞吐能力，可能對新生隱球菌穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障是有利的。這也可能是導(dǎo)致新生隱球菌穿越氣血、血腦屏障的機(jī)理之一。如能弄清這種機(jī)制產(chǎn)生的具體過程，抑制這一過程，可能對新生隱球菌病