1、目的：研究口腔癌患者外周血單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)的形態(tài)、表型和功能，分析患者性別、年齡、腫瘤的大小、臨床分期、病理類(lèi)型、分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素對(duì)DC功能的影響，了解口腔癌患者DC的功能狀態(tài)，研究經(jīng)不同方式負(fù)載抗原對(duì)DC形態(tài)及功能的影響，探討DC介導(dǎo)的特異性抗腫瘤應(yīng)答機(jī)制，以期為口腔癌的生物治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 第一部分不同臨床因素對(duì)口腔癌患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞生物學(xué)

2、特性的影響研究 選取2005年3月-2006年7月在我院口腔科住院的30例原發(fā)口腔癌患者為研究對(duì)象(A組)，均無(wú)其他系統(tǒng)性疾病，其中男性19例，女性11例；年齡為30-60歲，中位年齡49歲；Ⅰ期忠者6人，Ⅱ期患者8人，Ⅲ期患者11人，Ⅳ期患者5人；腫瘤最大8cm×5cm×4cm，最小1．5cm×1．0cm×0．3cm；鱗癌21例，腺癌9例；高分化+中分化癌患者23例，低分化+未分化癌患者7例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

3、者1 8例。對(duì)照組選用30例健康志愿者(B組)。采集A和B組每位受試者外周血50ml，分離單個(gè)核細(xì)胞，用GM-CSF，IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)5天，隔天換液并計(jì)數(shù)。第7d在培養(yǎng)體系內(nèi)加入TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于第5、7、10、14天獲取DC。培養(yǎng)過(guò)程中用倒置顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察DC的表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面分子CD1a、CD83、CD80、C1986和HLA-DR的表達(dá)情況；用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)混合

4、淋巴細(xì)胞試驗(yàn)(MLR)中DC細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用；用ELASA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-12的分泌量。 第二部分口腔癌患者外周血來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞體外負(fù)載抗原后抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究 無(wú)菌采集20例口腔癌患者(臨床Ⅰ、Ⅱ期)和20例健康志愿者外周血50ml(肝素鈉抗凝)，分離單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，并將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞(DC)各分為三組，A組為未處理組，B組為凍融組，C組為RNA轉(zhuǎn)染組。A組DC在培養(yǎng)5d后，每孔加入TN

5、F-α 200U/ml(終濃度)；B組DC培養(yǎng)第5d后，每孔中加入癌細(xì)胞蛋白抗原，使DC/腫瘤細(xì)胞=1：1，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔加入TNF-α200U/ml(終濃度)；C組．將培養(yǎng)至第5d的未成熟DC用腫瘤細(xì)胞RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染(DC：RNA=1×10<'5>/ml：5ug，按照invitrogen DMRIE-C試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)，轉(zhuǎn)染結(jié)束后用完全培基取代轉(zhuǎn)染劑，每孔加入TNF-α200U/ml(終濃度)。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至第7d，用流

6、式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分予的表達(dá)。將非貼壁細(xì)胞用含終濃度為200U/mlIL-2的RPMII640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7d時(shí)，將上述細(xì)胞分別與各組DC以10：1的比例混合，培養(yǎng)7d后再用各組DCs刺激一次，繼續(xù)培養(yǎng)一周后，收集CTL細(xì)胞，以異體卵巢癌細(xì)胞作對(duì)照，用LDH法(乳酸脫氫酶殺傷試驗(yàn))檢測(cè)CTL對(duì)口腔癌細(xì)胞的特異性殺傷活性，并用ELISA法檢測(cè)各組CTL培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ的分泌量。 第三部分樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的體

7、內(nèi)抑瘤作用和特異性免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究 建立舌癌細(xì)胞(Tca-83)裸鼠荷瘤模型，每?jī)商煊糜螛?biāo)卡尺測(cè)量并且記錄腫瘤縱徑(a)、橫徑(b)，按體積(V)=7cab2/6計(jì)算腫瘤體積。選取24只裸鼠隨機(jī)分成4組，其中A組6只為陰性對(duì)照組，只在皮下注射生理鹽水；B組為未處理DC激活的CTL組，在腫瘤長(zhǎng)出一周時(shí)于皮下注射(4×10<'7>/0．2ml)只，同時(shí)注射IL-2 1000U/只；C組為負(fù)載腫瘤抗原的CTL組，在腫瘤長(zhǎng)出一周時(shí)于小

8、鼠皮下注射(4×10<'7>/0．2ml)只，同時(shí)注射IL-2 1000U/只，第二周時(shí)重復(fù)注射一次； D組為RNA轉(zhuǎn)染的CTL組，注射方法及細(xì)胞數(shù)同C組。對(duì)以上各組荷瘤裸鼠每?jī)商煊^察腫瘤生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，計(jì)算抑瘤率。于接種腫瘤5周后，脫頸椎處死裸鼠，檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞周期的改變和細(xì)胞凋亡情況，測(cè)定荷瘤鼠體內(nèi)外周血中CD4<'+>和CD8<'+>T細(xì)胞表型變化。 結(jié)果 第一部分 1．口腔癌患者外周血單個(gè)核

9、細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后，可見(jiàn)貼壁單核細(xì)胞聚集成大小不等的細(xì)胞聚體，第3d可見(jiàn)細(xì)胞聚集成團(tuán)，少量懸浮生長(zhǎng)，部分細(xì)胞體積增大。第5 d，懸浮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞表面有細(xì)小突起形成。第7d懸浮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)顏色變深，有明顯樹(shù)突狀突起，直至第14d均為此典型形態(tài)，其中A組DC細(xì)胞表面突起少，胞漿內(nèi)空泡狀明顯。 2.口腔癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)第5d、第7d、第10d、第14d時(shí)，細(xì)胞表面DC分子的表達(dá)情況。 3.不同抗原負(fù)載方式

10、對(duì)DC細(xì)胞表型CD83、CD1a、HLA-DR、CD86和CD80的表達(dá)率的影響無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 4.MLR結(jié)果表明，各組DC對(duì)T細(xì)胞有不同程度的刺激作用，而且隨DC比例的增加而逐漸增強(qiáng)；抗原負(fù)載后的DC對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)和增殖作用均強(qiáng)于未負(fù)載組，且C<,2>(健康人RNA轉(zhuǎn)染組)>B<,2>(健康人負(fù)載腫瘤抗原組)、C<,1>(患者RNA轉(zhuǎn)染組)>B<,1>(患者負(fù)載腫瘤抗原組)(P<0.05)。3.LDH殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)

11、果顯示：效靶比高者殺傷率大，而且負(fù)載腫瘤抗原組CTL殺傷率高于未負(fù)載組，其中C<,2>>B<,2>、C<,1>>B<,1>(P<0.01)。 5.抗原負(fù)載后，Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ分泌量顯著增加。在未負(fù)載抗原前，A<,1>組(健康人未處理組)和A<,2>組(患者未處理組)IFN-γ分泌量很低，分別為60±8.9pg/ml、140+27pg/ml，用不同方式負(fù)載抗原后，IFN-γ的分泌水平顯著上升，且C<,1>>B<,1>、

12、C<,2>>B<,2>組(P<0.05)。 第二部分 1.將Tca-83細(xì)胞接種于24只裸鼠后，10～14天均長(zhǎng)出腫瘤，瘤體初期生長(zhǎng)緩慢，后期生長(zhǎng)加快，質(zhì)地堅(jiān)硬，表面光滑，與周?chē)M織無(wú)粘連。摘除的實(shí)體瘤經(jīng)病理學(xué)鑒定，確認(rèn)為T(mén)ca-83細(xì)胞移植瘤。 2.接種腫瘤細(xì)胞后第二周對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行第一次細(xì)胞治療，此時(shí)，4組裸鼠體內(nèi)腫瘤大小分別為0.030±0.014cm<'3>0.035±0.019cm<'3>，0.032±

13、0.017 cm<'3>及0.037±23cm<'3>，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。接受治療后，A組(生理鹽水組)裸鼠腫瘤持續(xù)增長(zhǎng)，荷瘤鼠出現(xiàn)形體消瘦；B組(未處理DC誘導(dǎo)的CTL)小鼠5天內(nèi)腫瘤體積縮小，但一周左右腫瘤則再度生長(zhǎng)，至處死時(shí)裸鼠體內(nèi)腫瘤的大小與未治療組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組(負(fù)載腫瘤抗原DC誘導(dǎo)的CTL)、D組(腫瘤RNA轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)的CTL)腫瘤生長(zhǎng)緩慢，至處死時(shí)兩組腫瘤大小與A、B組相比有明顯差異(

14、P<0.01)，D組CTL抑瘤效果優(yōu)于C組。 3.與A組相比，B、C、D組移植瘤細(xì)胞(G0/G1期細(xì)胞比率顯著增多(P<0.01)，S期細(xì)胞比率無(wú)顯著變化(P>0.05)，而(G2/M期細(xì)胞比率和PI值顯著降低(P<0.05)，且B、C、D三組之間均有顯著性差異(P<0.05)；從DNA直方圖上可以看出，A組細(xì)胞無(wú)凋亡現(xiàn)象，而B(niǎo)、C、D組瘤細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P<0.01)。 4.與A組相比，B、C、D組荷瘤鼠外周血中

15、CD4<'+>、CD8<'+>T細(xì)胞比例均顯著升高(P<0.01)，CD組CD4<'+>T細(xì)胞標(biāo)記率下降，CD8<'+>T細(xì)胞標(biāo)記率上升，與B組相比差異顯著(P<0.05)。 結(jié)論： 1．應(yīng)用GM-CSF、IL-4和HTNF-α三種細(xì)胞因子聯(lián)合可成功誘導(dǎo)口腔癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增為DC并向成熟型轉(zhuǎn)化，但在DC成熟后，CD80、CD86等共刺激分子表達(dá)率差異顯著，該現(xiàn)象與腫瘤的臨床分期、腫瘤的大小、腫瘤的分化程度及

16、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者的年齡、性別和病理類(lèi)型無(wú)關(guān)。 2．口腔癌患者的DC存在免疫功能缺陷，即使經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)，也不能使非成熟狀態(tài)的DC進(jìn)展為完全成熟狀態(tài)，該DC刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力較低，IL-12的分泌量少，經(jīng)自體腫瘤RNA或腫瘤裂解物處理后，免疫原性仍較差，因此需要一些細(xì)胞因子或佐劑的刺激，以提高殺傷活性。 3．用腫瘤裂解物負(fù)載和經(jīng)RNA轉(zhuǎn)染加載腫瘤抗原方式，均可以促進(jìn)口腔癌患者外周血中DC的成熟，使其表

17、面分子和共刺激分子等表達(dá)上調(diào)，可達(dá)正常人水平(P>0.05)。經(jīng)自體腫瘤抗原RNA轉(zhuǎn)染后的DC，其腫瘤殺傷活性及特異性強(qiáng)于負(fù)載腫瘤裂解物的DC，但患者組的殺傷率仍低于正常人組。 4．負(fù)載腫瘤抗原的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL可以有效控制荷瘤鼠體內(nèi)口腔癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其中RNA轉(zhuǎn)染組DC的特異性殺傷活性高于腫瘤裂解物負(fù)載組。負(fù)載腫瘤抗原DC所介導(dǎo)的CTL特異性殺傷作用的機(jī)制之一是改變移植瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 5．DC