1、第一部分1例新發(fā)成骨不全的突變鑒定及多態(tài)性篩查
　　 成骨不全( Osteogenesis imperfecta，OI)是一種結締組織疾病，其特點是不同程度的骨質脆弱，常伴隨身材矮小、藍鞏膜、聽力喪失、牙本質發(fā)育不全、韌帶及皮膚高度松弛等。成骨不全在全球范圍內的發(fā)病率約為1/10，000-1/15.000。
　　 Ⅰ型膠原蛋白是機體纖維膠原的主要組成部分，占據(jù)了哺乳動物四分之一的體重。它主要存在于骨骼、骨膜、皮膚、韌帶、

2、血管、鞏膜和角膜組織。若Ⅰ型膠原蛋白中的連續(xù)的三螺旋結構出現(xiàn)缺陷，則導致成骨不全。大多數(shù)成骨不全的病例是由于COL1A1或COL1A1基因發(fā)生突變所導致的，這兩個基因分別編碼Ⅰ型膠原蛋白的前α-1鏈和前a-2鏈。
　　 為了鑒定一家系中新發(fā)成骨不全病人的基因突變，我們應用PCR-DHPLC-DNA測序的基因診斷策略，發(fā)現(xiàn)在該病人COL1A1基因第36號外顯子內存在一個雜合突變2461(2461 G＞A)，導致原來的甘氨酸突變?yōu)榻z

3、氨酸(G821S)。多態(tài)性篩查排除該突變?yōu)槎鄳B(tài)的可能，因此，該突變很可能導致成骨不全。
　　 第二部分轉錄因子K1f4對小鼠Dppa2基因調控作用的
　　 初步研究
　　 Dppa2(Developmental Pluripotency-Associated gene2)是近幾年發(fā)現(xiàn)的在多能性細胞及某些癌組織中特異性表達的基因，與胚胎干細胞(ESCs)的多能性維持和自我更新有關，其表達抑制引起ESCs的分化。K1

4、f4在體細胞重編程為誘導性多能干細胞(iPS)的過程中發(fā)揮了重要作用，其在胚胎發(fā)育進程中的調控作用引起世人的廣泛關注。先前的研究證明Dppa2可能作為Oct4的靶基因參與到ESCs多能性維持和自我更新的調控網(wǎng)絡中來。本課題借助生物信息學分析以小鼠胚胎干細胞(mESCs)為材料，探索轉錄因子K1f4的表達變化對Dppa2表達的影響。
　　 通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)在Dppa2基因啟動子區(qū)存在4個K1f4的轉錄因子結合位點，推測Dp

5、pa2作為K1f4的靶基因參與ESCs不分化狀態(tài)的維持和自我更新。
　　 我們首先以mESCs的cDNA為模板，利用PCR獲得K1f4的開放閱讀框(ORF)，并將其克隆入真核細胞表達載體pCMV-myc中去，經(jīng)過PCR、DNA測序等鑒定構建成功。接著我們利用PLKO.1載體構建了針對小鼠K1f4基因的RNA干擾（RNAi）載體，同樣經(jīng)過測序證明構建成功。
　　 為了鑒定干擾效果，我們向人的293T細胞（不表達小鼠K1f4

6、基因）中，分別單獨轉染pCMV-myc-K1f4質粒，以及共轉過表達質粒和干擾質粒，并以未處理的293T細胞作為對照。通過RT-PCR、Realtime PCR、 Western Blot等檢測發(fā)現(xiàn)：單獨轉染K1f4真核表達質粒的293T細胞中可以檢測到K1f4的高表達，而兩種質粒共轉和未處理的293T細胞中幾乎檢測不到該基因的表達，可見K1f4的真核表達載體、以及針對小鼠K1f4基因的RNAi載體均可發(fā)揮作用。
　　 最后，我