1、本研究擬采用銀杏葉提取物(Ginkgobilobaextract，EGb761)對除草劑百草枯(1，1’-二甲基-4,4'-聯(lián)吡啶陽離子，Paraquat，PQ)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞(具有DA能神經(jīng)元特性)損傷施加干預(yù)，旨在證實(shí)EGb761對PQ所致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，并從細(xì)胞凋亡等病理過程揭示其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下： 實(shí)驗(yàn)一：篩選出PQ對PC12細(xì)胞損傷的有效濃度及EGb761對該濃度PQ損傷PC12細(xì)胞的有效保護(hù)濃度

2、。 研究方法：設(shè)0、50、100、200、300、400、500、600μmol/LPQ濃度組孵育24h及PQ300μmol/L分別作用0、4、8、12、24、48、72h；EGb761保護(hù)設(shè)正常對照組、0、1、10、20、40、60、80、100mg/L劑量組，采用MTT比色法和乳酸脫氫酶(LDH)釋放量測定法對各濃度進(jìn)行篩選。 研究結(jié)果：經(jīng)MTT比色法檢測，與對照組相比，50、100、200、300、400、500、

3、600μmol/LPQ組細(xì)胞生存率分別降至75.5％、69.6％、60.7％、52.3％、43.9％、25％、17％；PQ300μmol/L分別作用4、8、12、24、48、72h，其細(xì)胞生存率與對照組相比依次為85％、79.1％、72.8％、54％、35.9％、16.5％；對照組LDH的釋放量為0.242±0.005，PQ組LDH釋放量明顯增高0.267±0.032(與正常對照組相比P＜0.05)，EGb761保護(hù)組抑制了PQ所引起的

4、LDH釋放量的升高，其中40、60mg/LEGb761組明顯抑制了LDH釋放量的升高，分別為0.243±0.0046、0.243±0.007(與PQ組相比P＜0.05)。 研究結(jié)論：PQ對PC12細(xì)胞具有損傷作用，且這種損傷具有劑量和時間依賴性；EGb761對PQ所引起的PC12細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。 實(shí)驗(yàn)二：探討PQ對PC12細(xì)胞的損傷作用，觀測EGb761對該損傷的保護(hù)作用并探尋其作用機(jī)制。 研究方法：

5、MTT比色試驗(yàn)檢測細(xì)胞活性；LDH釋放測定細(xì)胞損傷程度；TUNEL染色觀測凋亡細(xì)胞DNA的斷裂情況；免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀測細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的表達(dá)。 研究結(jié)果：MTT法檢測顯示，EGb76120、40μg/ml均可明顯抑制300μMPQ所引起的PC12細(xì)胞活性的降低，與PQ組相比具有顯著性差異(P＜0.05)；300μmol/LPQ作用PC12細(xì)胞24h后，LDH釋放量明顯增多(236±8.8％)(與正常對照組相比P＜0.05)，使

6、用10，20，40μg/mLEGb761保護(hù)可明顯抑制PQ所致LDH釋放量的升高(分別為223±10.3％，188±9.8％和145±8.6％)，其中20，40μg/mLEGb761保護(hù)組與PQ組相比差異具有顯著性(P＜0.05)；300μmol/LPQ處理組(22％)與對照組(4.6％)相比顯著增加了TUNEL陽性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率，10、20、40μg/mlEGb761保護(hù)組降低了TUNEL陽性細(xì)胞與總細(xì)胞的比率，分別為19.4％、

7、13.7％、9.1％；PQ作用24h后，PC12細(xì)胞的Caspase-3表達(dá)明顯增強(qiáng)，染色細(xì)胞呈深棕黃色，陽性染色分布于胞質(zhì)和突起中，著色細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞形態(tài)改變，突起變短；EGb761保護(hù)組，細(xì)胞著色較淺，與PQ損傷組相比，細(xì)胞形態(tài)較為完好。 研究結(jié)論：EGb761可減輕PQ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷和凋亡，該作用可能與其抑制Caspase-3蛋白酶的活性有關(guān)。 實(shí)驗(yàn)三：探討EGb761對PQ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

8、。 研究方法：Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化；流式細(xì)胞儀(FCM)測定細(xì)胞凋亡百分率；Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡；Rhodamine123染色檢測細(xì)胞線粒體膜電位(Mitochondrialmembranepotential，MMP)。 研究結(jié)果：Giemsa染色顯示，PQ處理24h后，細(xì)胞數(shù)量減少，貼壁能力下降，突起變短，染色細(xì)胞核呈深紫色，并可見凋亡小體，部分細(xì)胞發(fā)生腫脹，胞膜損傷，呈現(xiàn)壞死現(xiàn)象；EG

9、b76110、20、40μg/ml保護(hù)組，細(xì)胞貼壁較好，核染色淡而均勻，突起較長，胞膜基本完整，且隨著EGb761濃度增加，PQ對細(xì)胞的損傷程度逐漸減小；FCM測得對照組、PQ組、10μg/mlEGb761組、20μg/mlEGb761組、40μg/mlEGb761組細(xì)胞凋亡百分率分別為6.3％、41.6％、34.8％、30.7％、25.7％，表明EGb761可有效抑制PQ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡；Hoechst33342染色顯示，PQ組

10、見大量濃染致密的凋亡細(xì)胞，且可見DNA熒光碎片，10、20、40μg/mlEGb761保護(hù)組，凋亡細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞熒光強(qiáng)度依次減低；PQ作用PC12細(xì)胞24h后，Rhodamine123染色示熒光強(qiáng)度明顯減弱(23.2±5.26％)，表明細(xì)胞MMP顯著下降；10、20、40μg/mlEGb761保護(hù)組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(分別為42.4±3.85％，65.42±4.07％和74.82±5.22％)，與PQ組相比均具有顯著性差異(P＜0.05)