1、研究背景：
　　靶向抑制酪氨酸激酶活性的甲磺酸伊馬替尼(Mesylate Imatinib，Imatinib)是目前臨床治療慢性粒細(xì)胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)和胃腸間質(zhì)瘤(Gastrointestinal stromal tumors，GISTs)的一線藥物。然而，經(jīng)Imatinib治療的約33％的慢性CML患者和約50％的GISTs患者由于逐漸出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥而導(dǎo)致病情進(jìn)展。目前

2、認(rèn)為Imatinib繼發(fā)性耐藥的主要機(jī)制包括兩大類:Breakpoint cluster region/Abelson tyrosine kinase(BCR/ABL)依賴性耐藥和BCR/ABL非依賴性耐藥。BCR/ABL依賴性耐藥主要原因包括:基因突變導(dǎo)致Imatinib與靶蛋白BCR/ABL的親和力降低，基因擴(kuò)增導(dǎo)致BCR/ABL表達(dá)增加。BCR/ABL非依賴性耐藥主要是由于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加降低細(xì)胞內(nèi)Imatinib有效濃度降低

3、所致。此外，腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增加也是BCR/ABL非依賴性耐藥的一個(gè)重要機(jī)制。
　　在先前的研究中，我們通過逐漸增加培養(yǎng)基中Imatinib藥物濃度的方法建立了一個(gè)Imatinib耐藥的K562細(xì)胞系KR。DNA測序發(fā)現(xiàn)KR細(xì)胞中BCR/ABL基因外顯子沒有任何新的基因突變。與K562細(xì)胞相比，KR細(xì)胞BCR/ABL的mRNA表達(dá)和蛋白水平均沒有明顯增加。上述結(jié)果提示KR細(xì)胞對Imatinib耐藥是一種BCR/ABL非依賴性的耐

4、藥。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中僅ABCB1有一定程度的升高，且高表達(dá)ABCB1已被證實(shí)對保護(hù)Imatinib誘導(dǎo)的K562細(xì)胞凋亡作用較弱。我們推測KR細(xì)胞的耐藥與其抗凋亡能力增強(qiáng)密切相關(guān)。那么有哪些（個(gè)）基因參與了KR細(xì)胞的凋亡抑制呢？
　　在分析K562細(xì)胞和KR細(xì)胞基因表達(dá)差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，一個(gè)小分子的信息傳導(dǎo)分子，BEX1(Brain expressed X-linked1)在KR細(xì)胞中出現(xiàn)了最顯著的轉(zhuǎn)錄“沉默”，與K56

5、2細(xì)胞比較，BEX1在KR細(xì)胞中下降了千余倍，并且在隨后有/無Imatinib存在下經(jīng)數(shù)十次的傳代后BEX1也無明顯增加。重新表達(dá)BEX1可顯著增加KR細(xì)胞的凋亡恢復(fù)對Imatinib的敏感性，提示KR細(xì)胞在耐藥過程中通過沉默BEX1而抑制Imatinib介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。目前對BEX1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不明了。因此，闡明BEX1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路，可為明確Imatinib的耐藥機(jī)制，逆轉(zhuǎn)Imatinib耐藥提供新的靶點(diǎn)和思

6、路。
　　研究方法：
　　本課題主要從蛋白質(zhì)相互作用角度出發(fā)，篩選與BEX1相互作用的蛋白質(zhì)，探索BEX1及其靶蛋白相互作用的生理功能及下游信號通路，從而闡明BEX1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。首先采用酵母雙雜交技術(shù)從穩(wěn)定過表達(dá)BEX1蛋白的KR細(xì)胞系KR/BEX1的cDNA文庫中篩選與BEX1相互作用的靶蛋白，然后用免疫共沉淀技術(shù)鑒定BEX1與靶蛋白的結(jié)合能力，細(xì)胞熒光技術(shù)分析BEX1與靶蛋白的空間共定位。結(jié)合生物信息學(xué)分析，構(gòu)建

7、BEX1不同氨基酸序列缺失的突變體，免疫共沉淀技術(shù)深入分析并明確BEX1與靶蛋白結(jié)合的具體位點(diǎn)。將結(jié)合域缺失的BEX1突變體，與野生型的BEX1分別轉(zhuǎn)染KR細(xì)胞，對比二者誘導(dǎo)凋亡能力的差別，明確BEX1和靶蛋白的結(jié)合與BEX1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)系。繼而采用蛋白質(zhì)免疫印跡、流式細(xì)胞分析等技術(shù)，進(jìn)一步分析BEX1與靶蛋白的結(jié)合啟動的細(xì)胞凋亡信號通路。本課題不僅對BEX1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路有所闡明，而且為明確Imatinib耐藥分子機(jī)制及逆

8、轉(zhuǎn)耐藥提供了新的思路。
　　研究結(jié)果：
　　1.BCL-2(B-cell lymphoma2)是BEX1的結(jié)合蛋白。
　　采用酵母雙雜交技術(shù)，從穩(wěn)定過表達(dá)BEX1蛋白的KR細(xì)胞(KR/BEX1) cDNA文庫中篩選并初步鑒定出BCL-2是BEX1的靶蛋白。將BEX1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)一步用免疫共沉淀技術(shù)確認(rèn)BEX1可以和BCL-2相互作用。
　　2.BEX1部分定位于BCL-2主要分布的細(xì)胞器-線粒體。

9、r>　　把BEX1的編碼序列分別插入到GFP(Green fluorescent protein)蛋白序列的N端和C端，構(gòu)建BEX1與GFP融合蛋白的表達(dá)載體。以GFP蛋白為對照，分別觀察融合于GFP蛋白N端BEX1蛋白(BEX1-GFP)、或融合于GFP蛋白C端的BEX1蛋白(GFP-BEX1)在線粒體的定位情況。將GFP-BEX1或BEX1-GFP分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染KR細(xì)胞，將線粒體用特異性染料Mito-Tracker標(biāo)記，激光共聚焦顯微

10、鏡發(fā)現(xiàn)GFP-BEX1和BEX1-GFP熒光均可部分定位于線粒體。應(yīng)用差速離心法分離純化細(xì)胞線粒體，線粒體蛋白免疫印跡結(jié)果與熒光定位完全一致，BEX1與GFP的融合蛋白GFP-BEX1或BEX1-GFP均能定位于線粒體。綜上，BEX1部分定位于BCL-2主要分布的細(xì)胞器-線粒體。
　　3.33K-64Q是BEX1與BCL-2結(jié)合及線粒體定位的重要結(jié)構(gòu)域。
　　采用分段克隆BEX1的辦法，構(gòu)建了BEX1一系列的不同肽段缺失突變

11、體，分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。通過各種缺失突變體與BCL-2免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)BEX1的33K-64Q肽鏈對與BCL-2的結(jié)合起著關(guān)鍵的作用。含有33K-64Q肽鏈的各種BEX1突變體能與BCL-2結(jié)合，而缺失33K-64Q肽鏈的BEX1失去了與BCL-2結(jié)合的能力。構(gòu)建33K-64Q結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失的BEX1Δ33K-64Q與GFP的融合蛋白，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染KR細(xì)胞，細(xì)胞熒光定位分析和線粒體蛋白免疫印跡均發(fā)現(xiàn)BEX1缺失了33K-6

12、4Q肽鏈后，不再定位于線粒體。因此，33K-64Q是BEX1與BCL-2結(jié)合及BEX1線粒體定位的重要結(jié)構(gòu)域。
　　4.BEX1與BCL-2的相互作用促進(jìn)Imatinib誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　采用流式細(xì)胞分析技術(shù)，對比瞬時(shí)表達(dá)BEX1和BEX1Δ33K-64Q誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。在沒有Imatinib誘導(dǎo)KR細(xì)胞凋亡時(shí)，表達(dá)BEX1或BEX1Δ33K-64Q的KR細(xì)胞凋亡水平均沒有明顯變化。予以Imatinib誘導(dǎo)凋亡24小時(shí)

13、后，表達(dá)BEX1的KR細(xì)胞凋亡顯著增加，而表達(dá)BEX1Δ33K-64Q蛋白的KR細(xì)胞凋亡沒有明顯變化，然而合用一種可與BCL-2結(jié)合的小分子化合物ABT-737后，表達(dá)BEX1Δ33K-64Q的KR細(xì)胞凋亡率又顯著上升，說明BEX1促進(jìn)Imatinib誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與其和BCL-2的結(jié)合顯著相關(guān)。綜上，BEX1與BCL-2相互作用促進(jìn)Imatinib誘導(dǎo)KR細(xì)胞凋亡。
　　5.BEX1與BCL-2的結(jié)合抑制BCL-2 Ser70的

14、磷酸化，促進(jìn)BCL-2/BAX聚合體的解離，BAX部分敲除可逆轉(zhuǎn)BEX1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　BCL-2主要通過調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平，蛋白磷酸化以及與BAX等蛋白的寡聚化來調(diào)控細(xì)胞凋亡。因此，我們分別研究了BEX1與BCL-2結(jié)合后，BCL-2這三方面的變化情況。在KR細(xì)胞分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BEX1和BEX1Δ33K-64Q48小時(shí)后，加入2uM Imatinib誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡24小時(shí)，蛋白分析發(fā)現(xiàn)BCL-2總蛋白水平在兩組中沒有明顯差別，而

15、Ser70磷酸化的BCL-2蛋白在轉(zhuǎn)染BEX1的KR細(xì)胞中降低了近一半。免疫共沉淀分析顯示，轉(zhuǎn)染BEX1后，KR細(xì)胞中BCL-2與促凋亡蛋白BAX的結(jié)合沒有檢測到，而轉(zhuǎn)染BEX1Δ33K-64Q的KR細(xì)胞中，BCL-2與BAX的結(jié)合沒有明顯變化。將BAX shRNA和BEX1共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染KR細(xì)胞，加入2uM Imatinib誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡24小時(shí)，流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)BAX表達(dá)降低可以削弱BEX1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。
　　研究結(jié)論：