1、RNA 干擾(RNA interference,RNAi)又稱(chēng)基因沉默,是生物體內(nèi)的一種自然現(xiàn)象,其機(jī)理為:外源性或內(nèi)源性的長(zhǎng)雙鏈RNA被核苷酶Dicer切割降解為21-23個(gè)核苷的小分子干擾RNA(siRNA)雙鏈,該siRNA分子被嵌合進(jìn)含有核苷酶的多蛋白復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)中,被其中的RNA解螺旋酶解開(kāi)雙鏈后的正義鏈隨后降解,由此激活的RISC復(fù)合體由該siRNA的反義鏈介

2、導(dǎo),靶向與該反義鏈序列互補(bǔ)的mRNA,并形成新的長(zhǎng)雙鏈RNA,然后又被Dicer酶降解為新的siRNA片段,靶mRNA即被降解或沉默,得到的siRNA進(jìn)入新一輪基因沉默循環(huán)。siRNA分子的基因沉默功能相對(duì)于同為核酸類(lèi)分子的反義核酸和核酶(ribozymes),特異性及沉默效應(yīng)更強(qiáng)且無(wú)免疫原性。因此,國(guó)內(nèi)外許多研究機(jī)構(gòu)迅速采用了siRNA分子技術(shù)來(lái)進(jìn)行疾病治療的研究,任何與疾病有關(guān)的表達(dá)基因都是潛在的靶標(biāo)。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞生

3、長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2)是一種酪氨酸激酶受體,由一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域,一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成,其與VEGF的信號(hào)通路在血管的形成過(guò)程中起重要作用。因此設(shè)計(jì)針對(duì)VEGFR2基因的siRNA分子來(lái)沉默其表達(dá)以阻斷VEGF/VEGFR2信號(hào)通路能夠抑制腫瘤新生血管的形成,從而具有治療腫瘤的應(yīng)用前景。但是作為RNAi效應(yīng)分子的siRN

4、A分子具有核酸和小分子化合物的雙重特性,當(dāng)其作為基因類(lèi)藥物在生物體內(nèi)應(yīng)用發(fā)揮疾病治療作用時(shí),容易被核酸酶降解,具有穩(wěn)定性差、半衰期短、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低和靶向性差等缺點(diǎn),因此,應(yīng)用siRNA分子的關(guān)鍵是如何有效地使其到達(dá)靶細(xì)胞并穿過(guò)細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的RNAi通路。目前siRNA分子給藥多借助載體,但存在靶向性差,安全性不明確和體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低等問(wèn)題:病毒載體基因轉(zhuǎn)染率高,但具有潛在的致痛性和免疫原性；陽(yáng)離了脂質(zhì)體具有較大的細(xì)胞毒性和

5、不穩(wěn)定性；陽(yáng)離子聚合物由于具有較低的免疫原性和細(xì)胞毒性,而備受研究者的青睞。目前常用的是陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine,PEI),其帶正電荷的氨基基團(tuán)與核酸帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)通過(guò)靜電吸附作用而發(fā)生電性中和,形成穩(wěn)定的納米-核酸復(fù)合物,表面電荷呈中性或弱陽(yáng)性,與表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜相互作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),具有較高的靶向性和轉(zhuǎn)染效率。
　　 為了探索siRNA分子經(jīng)組織靶向性結(jié)構(gòu)修飾后給藥的可行性,本文以未

6、修飾的PEI為載體包裹抗小鼠VEGFR2表達(dá)的siRNA分子(siVEGFR2),研究了其細(xì)胞特異性靶基因沉默效應(yīng),并在生物體內(nèi)比較了瘤內(nèi)和靜脈注射兩種不同給藥途徑對(duì)其介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)以及抗腫瘤生長(zhǎng)作用的影響,為下一步siVEGFR2分子經(jīng)組織靶向性結(jié)構(gòu)修飾的優(yōu)化給藥系統(tǒng)應(yīng)用于臨床治療腫瘤提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.研究PEI作為siRNA分子體內(nèi)外給藥載體的可行性。
　　 2.比較瘤內(nèi)和系

7、統(tǒng)兩種給藥途徑對(duì)PEI介導(dǎo)siVEGFR2抑制腫瘤生長(zhǎng)作用的影響。
　　 方法:
　　 1.制備siRNA/PEI以及siRNA/Lipofectamine2000復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染MS1細(xì)胞,同時(shí)以單純只加空載體PEI作對(duì)照。用共聚焦顯微鏡觀察PEI/Lipofectamine2000介導(dǎo)的siRNA在細(xì)胞內(nèi)的亞分布。
　　 2.制備siVEGFR2/PEI以及siVEGFR2/Lipofectamine2000復(fù)

8、合物分別轉(zhuǎn)染MS1細(xì)胞,同時(shí)以單純只加空載體PEI作為空白對(duì)照組和PEI轉(zhuǎn)染不針對(duì)任何靶基因的對(duì)照siRNA作為陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組。分別通過(guò)半定量RT-PCR(semi-quantitativeRT-PCR)和Western blot方法考察siVEGFR2分子轉(zhuǎn)染MS1細(xì)胞后對(duì)VEGFR2基因的RNAi效應(yīng)。采用one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)方法比較轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞VEGFR2mRNA和蛋白表達(dá)水平是否有顯著性差異。
　　 3.皮下接

9、種一定數(shù)量的A549肺痛細(xì)胞建立裸鼠皮下腫瘤模型,等到腫瘤可觸摸時(shí)用游標(biāo)卡尺定期測(cè)量腫瘤體積。腫瘤體積的計(jì)算公式為1/2×a×b2,其中a代表長(zhǎng)直徑,b代表短直徑。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到60-70mm3時(shí),分別腫瘤內(nèi)局部給予saline,隨即對(duì)照siRNA/PEI,siVEGFR2/Lipofectamine2000和siVEGFR2/PEI,以及靜脈內(nèi)給予siVEGFR2/PEI。每3天給藥1次,連續(xù)給藥5次,每次給藥前測(cè)得腫瘤體積以及荷瘤鼠

10、的體重。應(yīng)用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析比較給藥各組腫瘤體積和荷瘤鼠體重是否有顯著性差異。
　　 4.給藥結(jié)束后處死動(dòng)物取出腫瘤組織,分別通過(guò)半定量RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)和Western blot方法檢測(cè)給藥各組裸鼠腫瘤組織中VEGFR2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平考察siVEGFR2分子的體內(nèi)基因沉默效應(yīng)。采用one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)方法比較給藥各組裸鼠腫瘤組織中VEGFR2 mRNA和

11、蛋白表達(dá)水平是否有顯著性差異。
　　 5.用抗CD31抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色腫瘤組織切片,觀察各組腫瘤組織中的血管分布。
　　 6.用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)檢測(cè)各組裸鼠血清中細(xì)胞因子含量。采用one-wayANOVA統(tǒng)計(jì)方法比較給藥各組裸鼠血清中細(xì)胞因子的含量是否有顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.PEI和Lipofectamine2000都能將siRNA分子轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞胞漿的核周區(qū)域,從而使

12、siRNA分子進(jìn)入RNAi通路產(chǎn)生RNAi作用。
　　 2.體外轉(zhuǎn)染siVEGFR2至MSl細(xì)胞,能特異性沉默VEGFR2 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 3.腫瘤內(nèi)給予siVEGFR2/PEI的抗腫瘤生長(zhǎng)作用、特異性基因沉默作用以及抑制微血管生長(zhǎng)的作用均優(yōu)于靜脈給藥途徑,說(shuō)明未經(jīng)組織靶向性修飾的PEI不具有腫瘤靶向性,為進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化該給藥系統(tǒng)提供了基礎(chǔ)。
　　 4.給藥各組裸鼠血清中細(xì)胞因子的含量檢測(cè)結(jié)果和給藥