1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是好發(fā)于中老年人的一種運(yùn)動(dòng)障礙性疾病，主要的病理生化改變是選擇性中腦黑質(zhì)致密部（substantia nigra compact,SNc）多巴胺能神經(jīng)元變性缺失，導(dǎo)致下游的紋狀體（caudate putamen，CPU）多巴胺（dopamine,DA）含量顯著性降低，臨床上主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、靜止性震顫及姿勢(shì)步態(tài)異常。目前PD仍以藥物治療為主，如主流的左旋多巴（levodo

2、pa,L-dopa）替代治療，而長(zhǎng)期使用該藥會(huì)出現(xiàn)左旋多巴誘導(dǎo)異動(dòng)癥（levodopa-induced dyskinesia,LID）等遠(yuǎn)期并發(fā)癥，包括癥狀波動(dòng)（motor fluctuation）和運(yùn)動(dòng)障礙（dyskinesia）等，目前機(jī)制不清，尚無(wú)好的處理辦法。 國(guó)內(nèi)外研究人員針對(duì)PD及其運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究工作，也取得了一些進(jìn)展。隨PD病情不斷發(fā)展以及左旋多巴用藥，殘存的多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生多巴胺的能力喪失

3、，對(duì)外源性多巴胺藥物的緩沖能力降低，使得紋狀體內(nèi)多巴胺水平不能維持在生理狀態(tài)，對(duì)紋狀體中型多棘神經(jīng)元（medium spiny neurons,MSNs）表面分布的多巴胺受體形成異常的波動(dòng)性刺激。外源性用藥對(duì)多巴胺受體的波動(dòng)性刺激可能引起MSNs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化,進(jìn)而影響與之相關(guān)的其他受體的狀態(tài)及突觸傳遞效率。 多巴胺受體和谷氨酸受體共同表達(dá)于紋狀體MSNs胞膜表面，而大麻素CB1受體（cannabinoid receptor

4、 1,CB1）則位于皮質(zhì)紋狀體投射的谷氨酸能軸突末梢以及小清蛋白（parvalbumin,PV）陽(yáng)性的γ-氨基丁酸（GABA）能中間神經(jīng)元軸突末梢，和MSNs形成突觸聯(lián)系。大麻素CB1系統(tǒng)包括了CB1受體和內(nèi)源性大麻素（endocannabinoid，eCB），對(duì)突觸之間的信號(hào)傳遞具有重要調(diào)節(jié)作用。突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放能夠激活突觸后神經(jīng)元合成eCB，逆行穿過(guò)突觸間隙作用于突觸前膜CB1受體，激活CB1受體可抑制突觸前Ca2+內(nèi)流，最終反饋

5、性抑制突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放。 近年研究表明，PD紋狀體長(zhǎng)期失去多巴胺能支配，以及后續(xù)的長(zhǎng)期多巴胺替代治療波動(dòng)性刺激確實(shí)引起了大麻素CB1系統(tǒng)的一些改變。因此，對(duì)大麻素CB1系統(tǒng)的特性進(jìn)行研究將是本課題的基石。此外，目前迫切需要尋找和研發(fā)新型的抗PD藥物，以彌補(bǔ)已有藥物的不足。國(guó)外的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大麻素CB1系統(tǒng)對(duì)谷氨酸、GABA、多巴胺等多種重要神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用有調(diào)節(jié)功能。CB1受體激動(dòng)劑可引起動(dòng)物運(yùn)動(dòng)抑制，甚至出現(xiàn)僵硬癥（cat

6、alepsy）。并且Ferrer等研究發(fā)現(xiàn)CB1受體激動(dòng)劑具有減輕左旋多巴誘導(dǎo)的嚴(yán)重口舌部異常不自主運(yùn)動(dòng)的功能。但激活CB1受體是如何減輕運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的神經(jīng)生化機(jī)制，目前尚不清楚。本研究擬采用左旋多巴長(zhǎng)期治療誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的PD大鼠模型，試探討LID的發(fā)生機(jī)制，觀察使用CB1受體激動(dòng)劑對(duì)LID潛在的防治作用。 本課題共分為三個(gè)部分： 第一部分：左旋多巴誘發(fā)PD運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥大鼠模型的建立和評(píng)價(jià)引言。 通過(guò)6-羥基多巴（

7、6-OHDA）立體定向注射至SD大鼠右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束（medial forebrain bundle,MFB）建立單側(cè)PD大鼠模型，然后左旋多巴（L-dopa）腹腔注射治療（50 mg/kg 加12.5mg/kg芐絲肼,每天2次）3周，觀察異常不自主運(yùn)動(dòng)（abnormal involuntary movements,AIM）及旋轉(zhuǎn)行為。經(jīng)左旋多巴治療長(zhǎng)期治療，PD大鼠出現(xiàn)了AIM，包括刻板動(dòng)作和對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)行為。隨著左旋多巴用藥時(shí)間延長(zhǎng)，PD

8、大鼠AIM呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢(shì)，同時(shí)還伴隨著單位時(shí)間劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加、旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間縮短、關(guān)期頻率遞增等，與人類LID特征十分相似。 上述研究表明，本文成功建立了左旋多巴誘發(fā)PD運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥大鼠模型，為進(jìn)一步研究其形成機(jī)制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 第二部分：大麻素CB1受體在PD及其運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥大鼠基底節(jié)的表達(dá)研究。 采用免疫組化（immunohistochemistry,IHC）染色的方法，觀察大麻素CB1受體在假手術(shù)對(duì)照組大

9、鼠、6-OHDA單側(cè)毀損PD大鼠以及長(zhǎng)期使用左旋多巴形成LID大鼠基底節(jié)的紋狀體、蒼白球（globus pallidus,GP）以及黑質(zhì)網(wǎng)狀部（substantia nigra reticular，SNr）表達(dá)情況。Western Blot的方法，觀察假手術(shù)對(duì)照組大鼠、PD大鼠以及LID大鼠紋狀體內(nèi)CB1受體的表達(dá)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-OHDA單側(cè)毀損PD大鼠損傷側(cè)紋狀體和GP部位的CB1受體表達(dá)明顯增多；SNr內(nèi)的CB1受體則明顯

10、減少；長(zhǎng)期左旋多巴治療產(chǎn)生LID的大鼠損傷側(cè)和未損側(cè)紋狀體內(nèi)CB1受體與假手術(shù)對(duì)照組比較均有增加，并以未損側(cè)增加為主，但損傷側(cè)較PD組有所降低；GP內(nèi)的CB1受體數(shù)量較對(duì)照組仍然增加；損傷側(cè)SNr CB1受體表達(dá)也顯著上調(diào)。 上述研究提示，6-OHDA損傷SNc多巴胺能神經(jīng)元可引起基底節(jié)內(nèi)CB1系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)改變，而長(zhǎng)期左旋多巴治療則使CB1系統(tǒng)的改變更為復(fù)雜。大麻素CB1系統(tǒng)發(fā)生的改變可能是一種對(duì)多巴胺系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)改變的一種內(nèi)源

11、性代償，可能與PD及LID運(yùn)動(dòng)功能異常的產(chǎn)生有關(guān)。 第三部分：CB1受體激動(dòng)劑WIN55212-2改善PD運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥的實(shí)驗(yàn)研究。 通過(guò)6-OHDA立體定向注射至大鼠右側(cè)MFB建立經(jīng)典的嚙齒類PD動(dòng)物模型，對(duì)成功的PD大鼠模型進(jìn)行兩套實(shí)驗(yàn)：第一套實(shí)驗(yàn)中PD大鼠接受每日兩次左旋多巴（50 mg/kg 加12.5 mg/kg芐絲肼,每天2次）腹腔注射，持續(xù)21天。在第22天左旋多巴注射前15min，先接受CB1受體特異性激動(dòng)劑

12、WIN55212-2（1mg/kg）腹腔注射；第二套實(shí)驗(yàn)中PD大鼠每日兩次分別接受WIN55212-2+左旋多巴/芐絲肼腹腔注射，共持續(xù)21天，藥物劑量同上。評(píng)估用藥后大鼠的旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)變化和關(guān)期發(fā)生率；采用Western Blot的方法檢測(cè)紋狀體MSNs信號(hào)傳導(dǎo)通路下游重要的信號(hào)蛋白DARPP-32（Thr75）、ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化情況。 結(jié)果顯示，短期應(yīng)用CB1受體激動(dòng)劑WIN55212

13、-2對(duì)LID作用并不明顯。長(zhǎng)期聯(lián)合應(yīng)用WIN55212-2和左旋多巴，減輕了單獨(dú)長(zhǎng)期使用左旋多巴所至的PD大鼠旋轉(zhuǎn)反應(yīng)時(shí)間縮短、劑峰旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加的趨勢(shì)，并使關(guān)期發(fā)生頻率明顯減少；CB1受體阻斷劑AIM251與WIN55212-2聯(lián)合應(yīng)用則消除了WIN55212-2的減輕LID效應(yīng)，提示所觀察到的WIN55212-2的效應(yīng)是通過(guò)CB1受體起作用的。PD大鼠紋狀體內(nèi)的DARPP-32（Thr75）磷酸化與假手術(shù)相比未見(jiàn)明顯變化，而左旋多巴使

14、之降低，WIN55212-2與左旋多巴合用，DARPP-32（Thr75）降低更為顯著；ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化在PD紋狀體則減少，長(zhǎng)期左旋多巴治療使ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化明顯增加，聯(lián)用CB1受體激動(dòng)劑和左旋多巴并未使ERK（Thr202/Tyr204）磷酸化恢復(fù)正常，仍然高于對(duì)照組。 上述研究表明，WIN55212-2是通過(guò)CB1受體起作用的，激動(dòng)CB1受體可能對(duì)于PD左旋多巴誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)并