1、研究背景：
　　 腫瘤,作為一種嚴(yán)重影響人群健康的慢性疾病,發(fā)病率和死亡率逐年上升。在發(fā)展中的中國,日益增長的發(fā)病人數(shù)及治療費用,已經(jīng)成為制約社會進(jìn)步和發(fā)展的絆腳石。腫瘤治療經(jīng)歷了傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療,到分子靶向治療,似乎人類對腫瘤的認(rèn)識還非常有限,盡管目前已經(jīng)公認(rèn)腫瘤是一種全身系統(tǒng)性的疾病,腫瘤學(xué)家也試圖通過系統(tǒng)地綜合治療,但目前尚未取得理想的效果。
　　 顯然,傳統(tǒng)的治療手段不足以消滅腫瘤,我們能否從腫瘤的生物學(xué)行

2、為中尋找新的方法呢?腫瘤學(xué)家正試圖通過干預(yù)腫瘤免疫來尋找答案,免疫治療應(yīng)用于腫瘤治療,并成為目前臨床關(guān)注的熱點之一。腫瘤免疫治療的目的是激發(fā)或調(diào)動機體的免疫系統(tǒng),增強腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力,從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤免疫學(xué)治療的方法種類繁多,已與現(xiàn)代生物高科技結(jié)合,發(fā)展成為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種腫瘤治療模式。免疫增強劑是一類具有廣泛生物學(xué)活性和抗腫瘤活性的生物制劑,既包括一大類天然產(chǎn)生的生物物質(zhì),又包括能改變體內(nèi)宿主和腫瘤平衡

3、狀態(tài)的方法和手段,被廣泛用于抗腫瘤治療。雖然作用機制多種多樣,但不外乎兩大方面:通過干擾細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移的直接抗瘤作用或通過激活免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞因子來增強特異性免疫,達(dá)到對腫瘤殺傷或抑制的目的。在臨床治療中已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。Okamoto H等最早用鏈球菌制備出抗腫瘤制劑OK-432。該制劑不僅具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,亦能增強機體的抗腫瘤免疫功能,如:激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及補體系統(tǒng),已應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療。越

4、來越多的研究表明在實體腫瘤和血液惡性腫瘤患者中外周血和腫瘤局部微環(huán)境中Treg數(shù)目增多,比例增高,且數(shù)目與患者腫瘤進(jìn)展程度、預(yù)后和生存率呈負(fù)相關(guān)。本中心前期實驗表明采取太空滅活鏈球菌免疫序貫瘤內(nèi)注射的治療方法發(fā)現(xiàn),經(jīng)過滅活鏈球菌免疫后小鼠的效應(yīng)細(xì)胞更快地被募集,腫瘤MHC-Ⅰ類抗原上調(diào),減少了腫痛局部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量,可以有效地在改善腫瘤局部免疫狀況,有良好的抗腫瘤作用。序貫療法目前尚無明確的定義,藥物的序貫療法通常是指連續(xù)用藥達(dá)到藥

5、物穩(wěn)定的抗腫瘤血藥濃度后改用口服制劑或暫停用藥,以維持有效藥物在血漿中的濃度。序貫療法可縮短住院時間,降低治療費用,特別對于需要長期維持給藥的患者,可以預(yù)防長期靜脈輸液引起的感染,減少藥物副作用所致的死亡,是值得臨床推廣的一種治療方法。針對免疫制劑長期應(yīng)用,本研究在前人實驗結(jié)論的基礎(chǔ)上,設(shè)計使用太空滅活鏈球菌作為異種抗原來探索不同的瘤內(nèi)給藥模式對小鼠S180腫瘤的抗腫瘤作用,荷瘤小鼠對太空滅活鏈球菌治療的耐受性以及重要器官病理學(xué)改變,重

6、點分析太空滅活鏈球菌瘤內(nèi)注射后對Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)的影響。
　　 目的：
　　 研究太空滅活鏈球菌瘤內(nèi)注射對S180荷瘤小鼠抗腫瘤療效、荷瘤小鼠腫瘤組織內(nèi)凋亡相關(guān)Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)的影響以及長期用藥后對肝臟和腎臟毒性作用的初步探索。
　　 方法
　　 1.S180實體瘤小鼠模型構(gòu)建 4-6周齡雌性昆明小鼠40只,獲贈S180腹水小鼠,觀察后五日后無菌抽取腹水,培養(yǎng)3-4代后細(xì)胞生長

7、旺盛,制成癌細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/ml,取0.1ml用于小鼠背部皮下接種以制作實體瘤模型,成瘤率近100％。
　　 2.實驗動物分組:造模成功后第8天按大小均一性原則選取30只分成三組,每組10只:A、太空滅活鏈球菌連續(xù)瘤內(nèi)注射組；B、太空滅活鏈球菌序貫組瘤內(nèi)注射組；C、生理鹽水瘤內(nèi)注射空白對照組。
　　 3.瘤內(nèi)注射藥物及安慰劑 按照分組開始進(jìn)行瘤內(nèi)注射(A組小鼠連續(xù)每天瘤內(nèi)注射濃度為1mg/ml的太空

8、滅活鏈球菌0.1ml/只；B組小鼠連續(xù)5天瘤內(nèi)注射濃度為1mg/ml的太空滅活鏈球菌0.1ml/只,然后休息2天,C組瘤內(nèi)注射生理鹽水0.1ml/只)。研究以荷瘤小鼠的死亡為觀察終點。所有瘤內(nèi)注射均嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,采取多點注射。
　　 4.觀察和測量實驗數(shù)據(jù) 注射后每周測量腫瘤大小,計算腫瘤體積,腫瘤體積按公式:長徑×寬徑×寬徑/2。記錄各組小鼠治療后生存時間。
　　 5.免疫組織化學(xué)技術(shù)測腫瘤組織Bcl-2、Bax蛋

9、白表達(dá)
　　 6.圖片的數(shù)字化處理 每組免疫組化染色切片按隨機原則選取5個不同顯色部位,NIKON TE顯微鏡×400下拍照,保存圖片資料,使用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行染色光密度分析。
　　 7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計 使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)使用(x)±s表示,腫瘤體積使用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,生存期使用Kaplan-Meier法分析,免疫組化圖片積分光密度使用單因素方差分析。
　　 8.獲取荷

10、瘤小鼠肝臟和腎臟標(biāo)本,經(jīng)HE染色觀察組織病理學(xué)改變。
　　 結(jié)果
　　 1.小鼠S180腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)后生長旺盛,接種皮下成瘤率高。
　　 2.連續(xù)注射組和序貫注射組用藥后每周的腫瘤平均體積均呈下降趨勢,與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000)。連續(xù)注射組和序貫注射組之間差異不明顯(P=0.81),無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.各組小鼠生長曲線表明,連續(xù)注射組、序貫注射組和對照組荷瘤小鼠治療后中位生存時間分

11、別為38.0天、37.0天、34.0天。連續(xù)組與序貫組比較,P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義；連續(xù)組與塒照組比較,P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；序貫組與對照組比較,P<0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.瘤內(nèi)注射太空滅活鏈球菌組與對照組比較,太空滅活鏈球藺瘤內(nèi)注射組的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減低,Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。
　　 5.太空滅活鏈球菌作為異種抗原瘤內(nèi)注射主要作用于腫瘤局部,