1、研究背景：
　　三氯乙烯(TCE)是一種工業(yè)上廣泛使用的有機溶劑,由于使用量大且短期內(nèi)無法被禁止使用,從而導致暴露人群呈現(xiàn)升高趨勢。TCE主要通過皮膚和呼吸道進入人體,造成機體多系統(tǒng)損傷。近年來,在職業(yè)人群中發(fā)生的三氯乙烯藥疹樣皮炎(DMLT)引起職業(yè)衛(wèi)生領域的廣泛關注。三氯乙烯藥疹樣皮炎患者發(fā)生皮膚損傷的同時還存在肝腎損傷,并且肝腎損傷所導致的肝腎功能衰竭成為了 DMLT患者死亡的主要原因之一。因此,對于三氯乙烯所致的肝腎損傷機

2、制的研究在 DMLT患者的預防和治療工作中顯得尤為重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),補體系統(tǒng)的過度激活在三氯乙烯所致的免疫性肝腎損傷過程中發(fā)揮一定的作用,補體通過級聯(lián)反應最終形成攻膜復合物(MAC),并且MAC能夠引起肝腎等臟器造成損傷。補體系統(tǒng)在激活的三種途徑中,除了最終形成攻膜復合物之外,均有過敏毒素C5a的產(chǎn)生。C5a與表達在細胞表面的受體結合,從而可以激發(fā)細胞脫顆粒,釋放組胺之類的活性介質,引起血管擴張、通透性增加、平滑肌收縮以及支氣

3、管痙攣等癥狀。一些國內(nèi)外臨床研究表明,在一些腎臟疾病包括腎移植的發(fā)生發(fā)展過程中都有 C5a的參與,所以對于補體活化產(chǎn)物 C5a在三氯乙烯所致的腎臟損傷過程中的作用研究對DMLT患者的防治有一定的實際意義。
　　研究目的：
　　通過檢測三氯乙烯致敏小鼠不同時點和不同組別小鼠腎臟中補體片段C5a沉積水平、受體C5aR的表達水平以及補體片段C5a與其受體C5aR的結合情況,并且結合腎功能和腎臟病理等指標,來探討補體片段C5a在三氯

4、乙烯致敏小鼠腎臟損傷過程中的作用。
　　研究方法：
　　選取6-8周健康雌性BALB/c小鼠113只,經(jīng)適應性飼養(yǎng)一周后隨機分成空白對照處理組、溶劑對照處理組、TCE處理組和C5aRA處理組(在TCE處理組模型基礎上另給予C5aR拮抗劑/C5aRA預處理)。建立BALB/c小鼠致敏模型,觀察并記錄小鼠背部受試部位皮膚致敏反應情況。在末次激發(fā)后24 h對小鼠皮膚反應情況進行評分,并與24 h、48 h、72 h和7 d四個時點

5、收集小鼠血清,無菌取小鼠腎臟組織,并且根據(jù)評分情況將TCE處理組和C5aRA處理組小鼠分別分為致敏24h、48h、72h和7d組以及未致敏24h、48h、72h和7d組。采用全自動生化儀檢測各組血清中 Cr、BUN水平,HE染色法觀察小鼠腎臟病理變化。采用免疫組織化學法檢測各組小鼠腎臟中補體片段C5a的沉積以及受體C5aR的表達。免疫熒光雙標法檢測補體片段C5a與其受體C5aR的結合情況。
　　結果：
　　1.致敏情況

6、>　　在所有受試實驗動物中,空白對照處理組和溶劑對照處理組小鼠背部皮膚受試部位均未見任何紅斑或水腫,50只TCE處理組小鼠中有21只小鼠背部皮膚受試部位出現(xiàn)不同程度的紅斑或水腫,51只C5aRA處理組小鼠中有26只小鼠背部皮膚出現(xiàn)不同程度的紅斑或水腫,致敏率分別是42％和51%,致敏強度為中度。
　　2.腎功能檢測結果
　　腎功能檢測結果顯示,與空白對照組相比,溶劑對照組小鼠血清中Cr、BUN水平?jīng)]有明顯變化,差異無統(tǒng)計學意

7、義(P>0.05)。與溶劑對照組相比,TCE致敏24 h、48 h和72 h組Cr水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),C5aRA致敏48 h和72 h組Cr水平明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與TCE致敏48 h和72 h相應時點比較,C5aRA致敏48 h和72 h組Cr水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與溶劑對照組相比,TCE致敏48 h和72 h以及C5aRA致敏72 h組BUN水平明顯升高,

8、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與TCE致敏48 h和72 h組相比,C5aRA致敏48 h和72 h組BUN,Cr水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與TCE致敏7 d組相比,C5aRA致敏7 d組Cr水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.腎臟病理檢測
　　HE病理染色顯示,空白對照組小鼠腎臟沒有出現(xiàn)病理學改變,溶劑對照組小鼠腎臟與空白對照組小鼠腎臟相比,沒有明顯的病理學改變和炎性細胞浸潤

9、。與溶劑對照組小鼠腎臟相比,TCE致敏組小鼠腎臟中出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤,同時伴隨腎小球旁器畸形增生和腎小管形態(tài)學改變(包括腎小管結構改變、腎小管上皮細胞溶解),并且在TCE致敏72 h組最為明顯。與溶劑對照組小鼠腎臟相比,C5aRA致敏組小鼠腎臟出現(xiàn)炎性細胞浸潤和腎小管系形態(tài)學改變,與TCE致敏組小鼠腎臟相比,C5aRA致敏組小鼠腎臟炎性細胞浸潤以及腎小管和腎小球的損傷有明顯的減輕趨勢。
　　4.TCE處理組激發(fā)后補體片段C5a

10、的沉積以及受體C5aR的表達
　　免疫組化及評分結果顯示,與空白對照組相比,溶劑對照組補體片段C5a的沉積沒有明顯的變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TCE致敏24 h、48 h和72 h組小鼠腎臟中出現(xiàn)補體片段C5a的沉積,與溶劑對照組相比,TCE致敏24 h、48 h和72 h組的沉積水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與溶劑對照組相比,TCE致敏7 d組小鼠腎臟中補體片段C5a的沉積水平未出現(xiàn)明顯變化,差異

11、無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白對照組相比,溶劑對照組受體 C5aR表達水平?jīng)]有明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與溶劑對照組相比,TCE致敏24 h、48 h和72 h組受體C5aR的表達水平出現(xiàn)明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與溶劑對照組相比,TCE致敏7 d組小鼠腎臟中C5aR的表達水平未出現(xiàn)明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有TCE處理未致敏組均沒有補體片段C5a的過度沉積以及受體C5aR的

12、明顯表達。
　　5.C5aRA處理組激發(fā)后補體片段C5a的沉積以及受體C5aR的表達
　　免疫組化及評分結果顯示,與溶劑對照組相比,C5aRA致敏24 h、48 h和72 h組小鼠腎臟中補體片段C5a的沉積水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與溶劑對照組相比,C5aRA致敏7 d組小鼠腎臟中補體片段C5a的沉積水平未出現(xiàn)明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與溶劑對照組相比,C5aRA致敏24 h、48 h

13、和72 h組小鼠腎臟中受體C5aR的表達水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與溶劑對照組相比,C5aRA致敏7 d組小鼠腎臟中受體C5aR的表達水平未出現(xiàn)明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。C5aRA各時點致敏組小鼠腎臟中補體片段C5a的沉積水平和受體C5aR的表達水平與相應TCE致敏各時點比較,補體C5a的沉積水平和受體C5aR的表達水平并未出現(xiàn)明顯的變化(P>0.05)。
　　6.TCE致敏組和C5aRA致

14、敏組小鼠腎臟中C5a與C5aR結合情況檢測
　　免疫熒光雙標法顯示,未給予 C5aRA預處理的TCE致敏組小鼠腎臟中,C5aR發(fā)揮生物學作用,C5a與C5aR相結合,形成淺黃色的復合物。給予C5aRA預處理的C5aRA致敏組小鼠腎臟中,C5aR生物學作用被抑制,C5a與C5aR沒有結合形成復合物,C5a和C5aR出現(xiàn)在腎小管周圍不同部位,C5a沉積在腎小管外周,C5aR表達于腎小管內(nèi)圈。
　　結論：
　　1.TCE在一