1、腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員，是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)的主要病原體之一。此外，EV71還可侵犯呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)而引起腦炎、心肌炎、肺水腫和弛緩性麻痹等癥狀。近年來(lái)亞洲地區(qū)的EV71流行呈上升趨勢(shì)。
　　 目的:
　　 1.擴(kuò)增EV71

2、毒株基因組全序列，篩選神經(jīng)毒力位點(diǎn);
　　 2.構(gòu)建VP1蛋白的表達(dá)載體及突變體，從VP1基因上尋找可疑毒力位點(diǎn)，比較突變前后其引起的細(xì)胞損傷的變化情況。
　　 方法:
　　 1.設(shè)計(jì)9對(duì)首尾相接的引物擴(kuò)增3株SC-EV71(SDLY96、SDLY107、SDLY153)基因組全序列，將此3株毒株的基因組全序列與本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增的3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)及GenBank中的25株臨

3、床類型明確的EV71毒株的基因組全序列進(jìn)行序列比對(duì)。
　　 2.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增23株EV71毒株的VP1基因并測(cè)序，以BioEdit7.09和Mega4.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 3.設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SDLY11及SDLY107株的VP1基因，構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/11VP1及pcDNA3.1(+）/07VP1。將3株SC-EV71(SDLY96、SDLY107、SDLY153)和3株MC-EV71(SD

4、LY1、SDLY11、SDLY48)的VP1序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出3個(gè)可疑氨基酸位點(diǎn)P98、P145及P289，設(shè)計(jì)突變引物，以pcDNA3.1(+)/107VP1為模板，同源重組PCR法構(gòu)建3個(gè)單個(gè)氨基酸突變的表達(dá)載體107VP1/K98E、107VP1/E145G、107VP1/A289T。上述5個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞后，Giemsa染色、間接免疫熒光、Western blot進(jìn)行細(xì)胞病變程度的定性檢測(cè)，乳酸脫氫酶法(LDH)細(xì)胞毒性

5、檢測(cè)法進(jìn)行細(xì)胞病變程度的定量檢測(cè)。
　　 4.從已測(cè)知全序列的6株毒株中，選取分離自死亡病例的SDLY107株，采用多種方法構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒，構(gòu)建失敗后合成全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒pCDNA3.1(+)/SDLY107，將全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒酶切線性化，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄制備RNA轉(zhuǎn)錄本，RNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞。
　　 結(jié)果:
　　 1.擴(kuò)增出SDLY96、SDLY107及SDLY153株的基因組全序列，將此3株毒株的基因組

6、全序列與本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增的3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)及GenBank中的25株臨床類型明確的EV71毒株的基因組全序列進(jìn)行序列比對(duì)，共篩選出3個(gè)有意義的位點(diǎn)，這三個(gè)位點(diǎn)分別為ValP814/IleP814、ValP1148/IleP1148和AlaP1728/CysP1728/ValP1728。
　　 2.擴(kuò)增出23株毒株的VP1基因。將此23株毒株的VP1序列與各基因型代表株的VP1序列進(jìn)行比對(duì)，

7、發(fā)現(xiàn)此23株EV71分離株與A、B基因型同源性較低;與C4亞型的C4a群代表株的核苷酸和氨基酸同源性分別為92.8％～93.5％和98.3％～99.3％，明顯高于其他亞型代表株的同源性。
　　 3.構(gòu)建了表達(dá)載體pcDNA3.1(+）/11VP1、pcDNA3.1(+)/107VP1及突變體107VP1/K98E、107VP1/E145G、107VP1/A289T。Giemsa染色顯示轉(zhuǎn)染了5種表達(dá)載體的細(xì)胞均有不同程度的細(xì)胞損

8、傷;間接免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染了5種表達(dá)載體的細(xì)胞均有亮綠色熒光信號(hào)產(chǎn)生;Western blot顯示轉(zhuǎn)染了5種表達(dá)載體的細(xì)胞均可表達(dá)34KD的VP1蛋白， LDH法細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示pcDNA3.1(+)/107VP1、107VP1/K98E、107VP1/A289T引起的細(xì)胞損傷程度最大且基本相同，pcDNA3.1(+)/11VP1引起的細(xì)胞損傷程度最小，107VP1/E145G引起的細(xì)胞損傷程度介于中間。
　　 4.由于構(gòu)建S

9、DLY107全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒失敗，將其序列送公司合成全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-SDLY107，將其酶切線性化，制備RNA轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞。目前尚未觀察到細(xì)胞病變，細(xì)胞培養(yǎng)物提取RNA后PCR鑒定也未獲得相應(yīng)片段。
　　 結(jié)論:
　　 1.全基因組序列比對(duì)篩選出3個(gè)可能與神經(jīng)毒力相關(guān)或與基因型相關(guān)的位點(diǎn)，分別為位于VP1的ValP814/IleP814、位于3A的ValP1148/IleP1148和位于3C