1、耐藥性金葡菌(methicillin-resistantStapHylococcusaureus，MRSA)是全球院內感染的首要病原菌。在中國＞80％的金葡菌臨床分離株是MRSA，在西方國家＞60％。金葡菌細胞壁肽聚糖合成是由青霉素結合蛋白(Penicillin-bindingproteins，PBPs)酶系完成的，PBPs有轉糖基酶(transglycosylasedomain，TGase)和轉肽酶(transpeptidasedom

2、ain，TPase)兩種酶學活性，催化細菌肽聚糖粘肽的交聯(lián)，以維持細菌固有形態(tài)。因肽聚糖為細菌必須，而在哺乳動物的組織和細胞中又不存在，因而細菌肽聚糖及其合成酶系都是藥靶的極佳候選者。β-內酰胺類抗生素能抑制其轉肽酶活性，進而殺滅敏感菌。但MRSA則能編碼一種PBP2a(penicillinbindingprotein2a，PBP2a)分子，對β-內酰胺類抗生素具有較低的親和力，幫助細菌躲避抗生素的攻擊。近年來的研究表明，PBP2a在M

3、RSA肽聚糖合成中只提供轉肽酶活性，而轉糖基酶活性須由PBP2提供，即MRSA的耐藥性是由PBP2和PBP2a共同表達的，均可作為藥靶。如果在分子水平將PBP2和PBP2a的功能域融合，構建并表達-嵌合藥靶，則可利用該藥靶進行TGase或/和TPase活性抑制物的篩選，獲得的抑制物可望研發(fā)成抗MRSA感染的新藥，同時其作用機制也得到闡明，即是通過阻斷肽聚糖合成而抑制MRSA的生長，這對預防和控制目前日益嚴重的耐藥性MRSA菌感染具有重要

4、意義。 本研究在對MRSAPBP2和PBP2a功能域進行充分分析的基礎上，通過分子設計，將PBP2N-端參與細菌肽聚糖骨架構建的糖基轉移酶區(qū)(TGase)，與PBP2aC-端參與肽絞鏈橋形成的轉肽酶區(qū)(TPase)編碼基因分別克隆，再經(jīng)分子生物學操作構建成TG-TPase嵌合藥靶，亞克隆于原核和真核表達載體，實現(xiàn)嵌合藥靶的原核、真核表達及嵌合藥靶的初步純化，并在金葡菌體內證實表達了的TG-TPase嵌合藥靶具有耐藥活性，為進一步

5、利用其酶學活性進行抗耐藥性金葡菌抑制劑的篩選奠定基礎。 其研究內容和結果主要包括以下幾個方面： 1.抗耐藥性金葡菌嵌合藥靶的設計：①金葡菌PBP2分子的序列多重比對分析；②耐藥性金葡菌PBP2轉糖基酶活性區(qū)的結構特點及其活性發(fā)揮；③耐藥性金葡菌PBP2a轉肽酶活性區(qū)的結構特點及其耐藥機制；④抗耐藥性金葡菌嵌合藥靶的設計。 2.MRSA耐藥相關TG-TPase嵌合藥靶在原核表達系統(tǒng)中的表達：①利用PCR分別從MRS

6、A基因組上擴增出PBP2aTPase、PBP2TGase基因，克隆入pMD18-T載體中構建了重組質粒pMD-TG和pMD-TP；②通過酶切連接pMD-TG/XhoⅠ-NotⅠ和pMD-TP/XhoⅠ-NotⅠ片段構建了帶有TG-TPase嵌合藥靶的重組質粒pMD-TG-TP，并亞克隆入表達載體pET22b+、pET30b+，轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)plysS；③對pET22b-TG-TP/Rosetta工程菌進行表達，并對

7、表達條件進行摸索，獲得的工程菌表達產(chǎn)物經(jīng)超聲裂解后，90％以上的融合蛋白質以包涵體的形式存在；④將pET22b-TG-TP/Rosetta工程菌表達得到融合蛋白包涵體經(jīng)Ni-NTA親和純化后，獲得純度達90％以上的目標蛋白，并對蛋白進行質譜和Westernblotting鑒定；⑤將純化好的融合蛋白質經(jīng)透析法復性，并采用Bradford法進行蛋白質定量后，凍存?zhèn)溆?；⑥為獲得融合蛋白抗體，將融合蛋白免疫Balb/c小鼠，得到相應抗體后加等體

8、積甘油凍存?zhèn)溆谩?3.MRSA耐藥相關TG-TPase嵌合藥靶重組畢赤酵母的構建與表達：①將TG-TPase嵌合藥靶插入真核表達載體pPIC9K，構建了pPIC9K-TG-TP重組質粒；②將構建好的重組質粒經(jīng)SalⅠ酶切線性化后，電轉化整合入GS115畢赤酵母中，用濃度逐漸增加的G418來篩選多拷貝菌株，并鑒定其表型；③對篩選出的菌株在DNA、mRNA及蛋白水平進行鑒定。結果表明，通過提取轉化子的基因組進行PCR擴增，可得到約1

9、923bp大小的片段，經(jīng)過對轉化子的誘導表達，RT-PCR可擴增出約1923bp大小的片段，均與預期結果一致。 4.MRSA耐藥相關TG-TPase嵌合藥靶在金黃色葡萄球菌中的表達及體內活性鑒定：①利用PCR分別從MRSA基因組上擴增出PBP2aTP'ase、PBP2TG'ase基因，克隆入pMD18-T在載體中構建了重組質粒pMD-TG'和pMD-TP'；②通過酶切連接pMD-TG'/XhoⅠ-NotⅠ和pMD-TP'/Xho

10、Ⅰ-NotⅠ片段構建了帶有TG-TP'ase嵌合藥靶的重組質粒pMD-TG-TP'，③重組質粒pMD-TG-TP'亞克隆入金葡菌表達載體pYT3，構建了pYT3-TG-TP'重組質粒并轉化大腸桿菌DH5α，待重組質粒鑒定正確后再電轉入金葡菌N315；④重組質粒在N315菌中進行修飾后再轉入MSSA中；⑤應用96孔板稀釋法測定了6種抗生素(苯唑西林、注射用亞胺培南、頭孢氨芐、加替沙星、萘夫西林、鹽酸萬古霉素)對pYT3-TG-TP'/MS

11、SA的MIC和MBC，并對重組菌的體外生長抑制曲線進行了測定，檢測結果顯示重組工程菌MIC和MBC有不同程度的改變，其中對苯唑西林、頭孢氨芐、加替沙星、萘夫西林的MIC和MBC值改變較為明顯；重組菌體外生長抑制曲線測定，顯示苯唑西林、頭孢氨芐、加替沙星、萘夫西林4種抗生素在不同濃度時對pYT3-TG-TP'/MSSA、pYT3/MSSA和MSSA菌密度之間的關系和體外殺菌效果，有效殺菌結果與其MIC值相同，證明了所構建的重組工程菌pYT

12、3-TG-TP'/MSSA具有了多重耐藥活性。 綜上所述，本研究設計了抗耐藥性金葡菌嵌合藥靶，并進行了TG-TPase嵌合藥靶的原核和真核表達，并在原核表達后，經(jīng)包涵體提取、變性、復性等實驗，純化得到了嵌合藥靶蛋白，為體外酶學活性實驗奠定了基礎。本研究還將TG-TPase嵌合藥靶在藥物敏感金黃色葡萄球菌(methicillinsensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)中進行了表達及活性研究，在細菌體內