1、目的
　　 Tolllikereceptors(TLRs)是模式識別受體中的一個家族。到目前為止,人們已經發(fā)現了至少11種人類的TLRs。TLRs表達在多種免疫細胞上,尤其是抗原遞呈細胞,如樹突狀細胞、巨噬細胞和B細胞等等。大量的研究已經表明Toll樣受體在天然免疫應答以及對抗微生物感染和組織損傷的適應性免疫應答中起著重要的作用。
　　 因為TLRs在免疫應答中起著如此重要的作用,早期的研究都是立足于表達在免疫細胞上的T

2、LRs的生物學功能和其重要性。然而,TLRs也表達在一些腫瘤細胞上,如黑色素瘤細胞、頭部腫瘤以及結腸癌等都有表達。之前有研究表明,表達在腫瘤細胞上的TLRs對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。例如,人頭頸部鱗癌細胞系上的TLR4被激活后能夠促進腫瘤的發(fā)展,并保護腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)攻擊;而用鞭毛蛋白活化乳腺癌細胞的TLR5后能夠抑制細胞增殖從而抑制腫瘤的生長。這表明不同的TLRs在腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。因此,研究表達在腫瘤上的TLRs的功

3、能是至關重要的。
　　 肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,在中國由肝癌引起的死亡率位居第三,對人類健康和生存產生了巨大的威脅。因此,急需尋找一種更為有效的治療肝癌的方法。TLRs在肝癌細胞上都有表達。有研究報道,腫瘤細胞上的TLR9活化能抑制細胞增殖促進細胞凋亡,有關TLR9激動劑對肝癌細胞的影響尚無報導;另外,TLR3激動劑polyI:C能促進肝癌細胞的凋亡,那么,TLR9激動劑與TLR3激動劑聯合應用對肝癌細胞的作用亦無報導。因此

4、,本文旨在探討TLR9激動劑單獨及TLR3和TLR9激動劑聯合對肝癌的抗腫瘤作用。
　　 方法
　　 1.RT-PCR檢測TLRs在肝癌細胞中的表達情況;
　　 2.細胞轉染:用Lipofectamine2000介導的方法將ODNM362Ctrl、ODNM362、ODN2006-G5、polyI:C以及TLR9特異性siRNA轉入HepG2和H7402細胞;
　　 3.MTT法檢測轉染ODNM362Ctr

5、l、ODNM362后細胞增殖情況;
　　 4.流式細胞術檢測細胞凋亡、細胞周期;
　　 5.實時定量PCR檢測細胞因子、受體及凋亡相關分子的基因表達;
　　 6.WesternBlot法檢測RIG-I、NF-κB、p-NF-κB以及IκB-α的蛋白表達水平;
　　 7.熒光檢測細胞凋亡及siRNA或pEGFP-N1進入細胞的效率;
　　 8.人肝癌細胞系HepG2細胞裸鼠皮下荷瘤;
　　

6、9.瘤內注射TLR9激動劑治療HCC
　　 結果
　　 1.TLR9激動劑能通過TLR9非依賴的途徑誘導肝癌細胞凋亡
　　 1.1TLR在肝癌細胞上的表達水平,除了TLR7、TLR8,其它的TLRs在三種肝癌細胞系中都有表達,TLR9的表達水平也較高;
　　 1.2ODNM362及ODNM362Ctrl均能抑制人肝癌細胞增殖,對H7402細胞的抑制作用更為明顯;
　　 1.3ODNM362及ODN

7、M362Ctrl對肝癌細胞周期無影響,但出現了明顯的凋亡峰,提示ODNM362及ODNM362Ctrl誘導細胞凋亡;
　　 1.4ODNM362及ODNM362Ctrl能誘導肝癌細胞凋亡,對H7402細胞的促凋亡作用更為顯著;
　　 1.5ODNM362和ODNM362Ctrl能上調TLR9和炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-α、IFN-β的表達;
　　 1.6ODNM362和ODNM362Ct

8、rl對IB-α及磷酸化的NFκB蛋白表達無影響,不能活化NFκB信號通路;
　　 1.7沉默TLR9后,ODNM362和ODNM362Ctrl誘導的肝癌細胞的凋亡無變化,是TLR9非依賴的;
　　 1.8轉染ODNM362的H7402細胞在裸鼠體內無法成瘤,ODNM362抑制體內腫瘤的形成;
　　 1.9ODNM362瘤內注射抑制體內腫瘤的生長。
　　 2.硫代磷酸酯修飾的TLR9配體通過阻止TLR3配體

9、的進入從而抑制其誘導的細胞凋亡
　　 2.1TLR9激動劑ODNM362能夠通過誘導人肝癌細胞凋亡抑制其增殖;
　　 2.2在結腸癌細胞系中ODNM362也能削弱由polyI:C誘導的細胞凋亡;
　　 2.3ODNM362能夠下調識別polyI:C的受體RIG-(I)、MDA5、LGP2、TLR3的表達;
　　 2.4ODNM362能夠下調由polyI:C誘導的凋亡基因Noxa、puma等的表達;

10、　　 2.5ODNM362能夠下調由polyI:C誘導的炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-α、IFN-β的表達;
　　 2.6在結腸癌細胞系中ODNM362也能削弱由polyI:C誘導的細胞凋亡;
　　 2.7硫代磷酸酯修飾的ODNM362Ctrl、ODNM362均能削弱polyI:C誘導的凋亡,而非硫代磷酸酯修飾的ODN2006-G5不能,CpGODN阻斷polyI:C誘導的凋亡依賴于其硫代磷酸酯的

11、修飾;
　　 2.8硫代磷酸酯修飾的CpGODN抑制熒光標記的siRNA或pEGFP-N1進入細胞,硫代磷酸酯修飾的CpGODN抑制polyI:C誘導的凋亡是通過阻斷polyI:C的進入實現的;
　　 2.9可以通過預先轉染CpGODN增強polyI:C的促凋亡作用。
　　 結論
　　 本研究發(fā)現,除了TLR7、TLR8,其它的TLRs在三種肝癌細胞系中都有表達,TLR9的表達水平也較高。TLR9配體OD

12、NM362及其對照ODNM362Ctrl均能誘導細胞凋亡從而抑制細胞增殖;TLR9和促炎因子的表達也有所上調,但是不能活化NFκB信號通路。ODNM362能抑制腫瘤在體內的形成和生長。
　　 本研究還發(fā)現,同時轉染polyI:C和ODNM362相比polyI:C單獨作用組細胞凋亡顯著下降,同時識別polyI:C的受體、促炎因子以及凋亡相關分子也都顯著下調。進一步的研究表明,這些效應是部分依賴于TLR9配體硫代磷酸酯修飾的結構,該