1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是人類主要的致病菌之一，通常在社區(qū)正常人體內(nèi)也有定居，在住院病人則常常引起嚴重的感染。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistance Staphylococcus aureus，MRSA)，單從命名來看，會給人以誤導，因為甲氧西林目前已經(jīng)不再用于金葡菌的臨床治療，其意義等同于多重耐藥的金黃色葡萄球菌。而隨著由MRSA引起的感染逐漸增多，治療起來也變

2、得越來越困難。粘附是指細菌通過其表面結(jié)構(gòu)或大分子物質(zhì)定居在細胞、人工材料等各種固體物質(zhì)表面的過程或能力。近年來，大量研究結(jié)果證明， 粘附是很多細菌致病的先決條件，是細菌與宿主相互作用的第一步，病原菌粘附于易感細胞、粘膜等之上后方能發(fā)揮其正常生理作用，從而引起感染致病。粘附是細菌致病的第一步，對細胞以及基質(zhì)的粘附促進細菌定植以及感染，對生物材料的粘附促進細菌生物膜的形成。細菌粘附是個復雜的過程，眾多機制參與其中，涉及了從單體蛋白質(zhì)

3、到極為復雜的大分子蛋白質(zhì)，不同細菌的粘附機制不盡相同。粘附起始靠的是布朗運動、范德華力、靜電吸引力等物理力作用，不穩(wěn)定、可逆的附于表面，液體的沖擊等即可使其移動、脫落。此過程非特異性，連接較松且易于分離；其后，細菌通過表面的菌毛、鞭毛等細胞器以及的特定粘附素蛋白(adhesin)與宿主細胞上的相應受體進行識別并相互作用，使其緊緊地附著于宿主細胞之上并進一步發(fā)揮其生理功能，該過程為具有選擇性和特異性，粘附后穩(wěn)定不易分離。產(chǎn)生較為牢固的受體

4、一配體樣特異性結(jié)合，此為粘附的主要過程。粘附成功以后，方開始其進一步損傷作用。所以，粘附力大小與致病力強弱直接相關。對金黃色葡萄球菌來說，介導粘附的主要為菌體表面的蛋白成分。包括纖維連結(jié)蛋白結(jié)合蛋白(FnBP)、膠原粘附素(CNA)、凝集因子(ClfA)、胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白(Emp)等。能夠與宿主細胞、基質(zhì)成分中的相應受體結(jié)合，促進細菌定植、長期存在。因此，作為MRSA的重要毒力因子之一，粘附力在其致病過程中占據(jù)重要地位，從1981年以后

5、，人們逐漸注意到了在抗菌藥物使用后細菌粘附能力發(fā)生的變化，并作了一系列研究，已有的研究結(jié)果表明，亞抑菌濃度的抗菌藥物能夠改變MRSA的粘附力，從而增強或減弱其致病力。對MRSA在抗菌藥物作用下粘附力改變的研究，將進一步揭示院內(nèi)MRSA感染的機制，為控制院內(nèi)MRSA感染提供新的策略，同樣也有助于研發(fā)新的抗感染生物材料。 材料和方法: 1、實驗菌株的準備 通過纖維支氣管鏡吸取呼吸內(nèi)科ICU內(nèi)MRSA肺炎患者下呼吸道分

6、泌物，經(jīng)細菌培養(yǎng)及分離，利用傳統(tǒng)生化鑒定結(jié)合藥敏結(jié)果確定為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。 2、抗菌藥物對MRSA的誘導 準備5種臨床常用抗菌藥物，分別為頭孢他啶、亞胺培南、環(huán)丙沙星、萬古霉素、阿奇霉素。根據(jù)美國國家臨床實驗標準委員會(NCCLS)抗菌藥物敏感性試驗操作標準，以液體對倍稀釋法測其分別對應于5種抗菌藥物的MIC,測定時以標準株(ATCC 29213)作為參照，以保證結(jié)果的準確性。繼而配制含有1/4MIC、1/16

7、MIC抗菌藥物的MH肉湯，加入菌液使其細菌濃度約為5×10<'5>CFU，37℃ 5﹪CO<,2>下孵育20小時，5000rpm,5min離心收集細菌，PBS洗滌2次，加入PBS使其重新懸浮并調(diào)整濃度至約1×10<'8>CFU/ml(OD=0.2，625nm)； 3、上皮細胞的培養(yǎng) 將人宮頸癌上皮細胞株(Hela細胞)轉(zhuǎn)至50cm<'2>培養(yǎng)瓶，加3ml含10﹪胎牛血清、2﹪HEPES的RPMl 1640完全培養(yǎng)液，放入

8、37℃，95﹪濕度，5﹪CO<,2>細胞培養(yǎng)箱，2～4天更換一次新鮮培養(yǎng)液，待細胞貼壁生長至培養(yǎng)瓶面積的80～90﹪傳代，約5～7天傳代一次。取用細胞時，吸出培養(yǎng)液，以D-HANKS液洗滌2次，加入胰蛋白酶-EDTA消化液，倒置顯微鏡下實時觀察細胞消化情況，若胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，表明細胞消化適度。棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液。用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。將細胞懸液吸入15ml離心管中。以1000rpm，8min離

9、心。棄上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。吹打均勻后，以血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，并調(diào)整細胞濃度為3×10<'5>/mL備用； 4、粘附實驗 4.1非特異性粘附實驗將細菌懸液濃度調(diào)整至10<'5>CFU/L，取菌液約0.2ml，均勻涂于玻片約1.0×1.0 cm<'2>區(qū)域內(nèi)，放入培養(yǎng)箱，37℃，5﹪CO<,2>4小時；繼而以無菌水漂洗玻片，去除未粘附的細菌，酒精燈干燥、固定殘留細菌，瑞氏法染色，置光學

10、顯微鏡下觀察每高倍視野(×1000)殘留細菌數(shù)量，每張玻片計數(shù)12個視野； 4.2特異性粘附能力 (1)以酶消化法制備Hela細胞懸液，并調(diào)整細胞濃度至3×10<'5>/ml； (2)將經(jīng)過抗菌藥物誘導的含菌肉湯離心，收集細菌，以PBS洗滌1次，再次加入PBS使其重新懸浮，根據(jù)比濁法及分光光度儀調(diào)整細菌濃度至約為1×10<'8>CFU/ml； (3)將制備好的細菌及細胞懸液按照1：1混合，置于37℃，5﹪CO<,2>培養(yǎng)箱中1小

11、時后取出，1000rpm，5min離心收集細胞，并以PBS洗滌3次，以去除未粘附之細菌，盡可能倒盡上清液，再次加入PBS液40榪重新懸浮細胞，并于蓋玻片上涂片，自然干燥后行瑞氏．吉姆薩染色，光學顯微鏡下觀察，計數(shù)不同抗菌藥物濃度下生長的細菌在細胞上的粘附比率。 5、統(tǒng)計學處理： 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X±SD)表示，應用SAS 8.01統(tǒng)計分析軟件包進行進行t檢驗及方差分析。P值<0.05被認為是有統(tǒng)計學意義的。

12、結(jié)果: 頭孢他啶、亞胺培南、環(huán)丙沙星能夠增強MRSA的粘附力。萬古霉素、阿奇霉素能夠降低MRSA的粘附力。討論與結(jié)論粘附是細菌定植、致病的先決條件，與細菌毒素一起決定了細菌的致病力。MRSA粘附力的增強或減弱是其表面蛋白表達增加或減少的結(jié)果。這些蛋白包括：纖維連接蛋白結(jié)合蛋白(Fnbp)、膠原粘附素(CNA)、凝集因子(CIfA)等。粘附的主要過程就是細菌表面的粘附分子與宿主細胞或細胞外基質(zhì)上的受體相互識別、結(jié)合的過程，抗菌藥物

13、在轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同水平作用于這一過程而影響MRSA的粘附力。由于存在結(jié)構(gòu)上的差異，不同類的抗菌藥物影響機制則不盡相同。本試驗結(jié)果提示：頭孢他啶、亞胺培南、環(huán)丙沙星等抗菌藥物顯示出能夠增加MRSA粘附力，而阿奇霉素、萬古霉素則起抑制粘附作用。目前，在臨床上，頭孢他啶、亞胺培南等β-內(nèi)酰胺類廣譜抗菌藥物的使用日益廣泛，而MRSA由于多重耐藥，在體內(nèi)，這些藥物難以達到有效抑菌、殺菌濃度，因此不能夠清除定居于上呼吸道MRSA，而頭孢他啶、亞胺培

14、南的使用反而使其粘附力增加，易于在下呼吸道定植并進一步致病。這與我們臨床觀察結(jié)果相一致。β-內(nèi)酰胺類廣譜抗菌藥物的廣泛使用有可能是造成院內(nèi)MRSA感染率增加的原因之一。環(huán)丙沙星的使用同樣能夠增強MRSA的粘附力，進而增加院內(nèi)MRSA肺炎的機會。經(jīng)過環(huán)丙沙星誘導后的MRSA，F(xiàn)nbpB的表達增加是其粘附力增強的原因。不同的臨床統(tǒng)計結(jié)果顯示，環(huán)丙沙星的使用容易導致院內(nèi)MRSA肺炎的發(fā)生。 萬古霉素能夠降低MRSA粘附力的作用，從而降

15、低致病力。然而，盡管萬古霉素表現(xiàn)出有效的抗MRSA活性(MIC=1.0mg/L)，甚至在抑菌濃度以下也能夠減弱其致病力，但為了減少耐藥的發(fā)生，應盡可能減少萬古霉素的使用，以維持其目前尚有效的抗MRSA活性。本次實驗結(jié)果提示亞抑菌濃度的阿奇霉素能夠減弱MRSA的粘附力，另有許多研究結(jié)果提示此類藥物包括紅霉素等能夠明顯減少MRSA外毒素的表達，抗菌機制與其相同的紅霉素、克林霉素也可能具有同樣作用。在MRSA所致的感染中，外毒素起著重要作用，

16、因此臨床上在治療MRSA感染時，若中毒癥狀較重，可考慮使用阿奇霉素、克林霉素等藥物以拮抗毒素作用，也許在今后，抗毒素治療有可能成為MRSA感染的重要治療措施。 本試驗揭示了各類抗菌藥物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌粘附能力的不同影響，結(jié)果提示：頭孢他啶、亞胺培南等β-內(nèi)酰胺類藥物能夠增加MRSA的粘附能力，進而增強其致病力，因此，它們的廣泛使用在一定程度上增加了MRSA感染的機會，可能是引起院內(nèi)MRSA肺炎的重要原因。而環(huán)丙沙星的使

17、用同樣顯示出增強粘附力的作用，也能夠增加院內(nèi)MRSA感染的發(fā)生機會。萬古霉素及阿奇霉素，則對MRSA粘附力存在抑制作用：萬古霉素的使用將不可避免增加耐藥性產(chǎn)生的機會；阿奇霉素除了能夠抑制MRSA的粘附力以外，還有可能減少其外毒素的產(chǎn)生，與其作用機制相同的紅霉素、克林霉素亦可能具有相似的作用。這對于臨床工作者在抗菌藥物的選用方面提供參考意義。合理的使用抗菌藥物，有助于控制院內(nèi)MRSA感染率，減少耐藥菌株的產(chǎn)生，達到最佳的治療效果。