1、背景/目的：各種病因所引起的慢性肝病絕大多數(shù)都有肝纖維化(hepati.fibrosis，HF)，其中25％～40％最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，是一類世界性的嚴(yán)重危害人們健康的主要疾病。目前的研究證實，肝星狀細胞(hepati.stellat.cells，HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。各種因素通過不同方式和途徑作用于肝臟中的HSC，導(dǎo)致其生物學(xué)及功能變化，引起肝纖維化。研究這群細胞復(fù)雜的病理生理機制將是抗纖維化治療發(fā)展的關(guān)鍵。<

2、br>　　 Wnt信號通路是近年來在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和腫瘤研究中的一大熱點，參與調(diào)控細胞的分化、癌變、凋亡及機體免疫、應(yīng)激等生理病理過程。最近有研究表明Wnt信號通路與HSC的活化及肝纖維化的發(fā)生相關(guān)，但有關(guān)Wnt信號通路相關(guān)分子在HSC活化中的作用尚無全面深入的研究。
　　 本課題首先利用基因芯片技術(shù)觀察Wnt信號通路相關(guān)分子在HSC活化前后表達水平的變化，并用實時聚合酶反應(yīng)(rea.tim.PCR.RT-PCR)驗證

3、部分表達變化基因；進而觀察外源性小鼠Wnt5a(recombinan.Mous.Wnt5a，rmWnt5a)蛋白對HSC-T6增殖及I型膠原合成的影響；以期探討Wnt信號通路在肝纖維化發(fā)生中的作用，進一步揭示肝纖維化的發(fā)生機制，為肝纖維化的防治提供新的可能途徑及干預(yù)靶點。
　　 方法：(1).利用膠原酶/鏈蛋白酶灌注Nycodenz梯密度離心分離大鼠HSC，于體外培養(yǎng)。(2).利用Affymetrix基因芯片觀察在HSC活化前后

4、基因譜表達水平的變化，結(jié)果中篩選出Wnt信號通路相關(guān)分子，以RT-PCR驗證部分表達變化的基因。(3).體外培養(yǎng)HSC-T6細胞，加入rmWnt5a蛋白，用CCK-8法檢測其對HSC-T6的影響。(4).用ELISA法觀察rmWnt5a蛋白對HSC-T6合成I型膠原的影響。
　　 結(jié)果：(1).基因芯片結(jié)果顯示，活化的HSC與新鮮分離的靜止的HSC比較，表達上調(diào)的Wnt信號通路相關(guān)基因共13條(Wisp2、Wnt4、Fzd2、P

5、LC、PKC、TGF-β1、Wisp1、TLE3、Ccnd2、Ccnd1、DKK3、Wifl、RhoA)。經(jīng)RT-PCR驗證了其中2條(Wnt4、Fzd2)，結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致。(2).CCK-8實驗結(jié)果顯示，濃度在0.2μg/mL～0.8μg/mL之間的rmWnt5a具有促HSC-T6增殖作用。當(dāng)rmWnt5a濃度在0.2μg/mL～0.4μg/mL時，隨著其濃度增長，對HSC-T6具有顯著的濃度依賴性促細胞增殖作用(p<0.05

6、)。當(dāng)rmWnt5a濃度在0.4μg/mL-0.8μg/mL時，僅有輕度濃度依賴性促細胞增殖作用的趨勢，無統(tǒng)計學(xué)上的差異(p>0.05)。(3).ELISA實驗結(jié)果顯示，HSC-T6培養(yǎng)細胞上清液中I型膠原含量隨著rmWnt5a濃度增加而逐漸增加。rmWnt5.0.2μg/ml組，0.4μg/ml組、0.8μg/ml組與對照組相比，I型膠原含量均有顯著性差異(p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1).Wnt信號通路參與了HSC的活化