1、目的：急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指由心源性以外的各種肺內外因素導致的急性、進行性呼吸衰竭。其發(fā)病急、病情重，死亡率高，臨床上主要表現(xiàn)為難治性低氧血癥、非心源性肺水腫、肺動脈高壓而體循環(huán)低血壓。其主要病理生理特點之一為急性肺水腫(APE)。該現(xiàn)象是指由于各種病因導致超常的液體積蓄于肺間質和/或肺泡內，形成間質性和/或肺泡性肺水腫。而在對抗發(fā)生肺水腫的過程中，肺泡上皮細胞發(fā)揮著不可替代的作用。由于各種直接或間接的

2、作用導致肺泡上皮細胞受到損傷時，其生理活性喪失：除表面活性物質減少外，細胞正常容積發(fā)生改變，肺泡肺泡細胞膜對于液體的轉運功能出現(xiàn)障礙，從而導致肺泡不能清除多余的液體導致水腫加重。而后兩者的作用又與肺泡細胞膜表面的離子通道有著密切的關系。
　　 在眾多的離子通道當中，鈉通道對于肺泡液體清除的作用已經(jīng)被證實。劉琳等在其實驗中也證實了肺泡上皮細胞中存在著水通道1(AQP1)，并且其在ARDS狀態(tài)下顯著下降。而做為生物體內含量豐富的氯離

3、子通道卻一直被人們所忽視。直到近年來人們才逐漸對氯離子通道關注起來。先后發(fā)現(xiàn)了鈣激活氯通道(Currents mediated by calcium-activated chloride channels(CaCCs))、容積（或稱體積）調控性氯通道(Volume-regulated anion channels，VRAC，ICl. swell)通道、電壓門控性氯通道(votage2gated chloride channels ClC

4、 family)、cAMP/蛋白酶激活的氯通道、配體激活的氯通道等。其功能多種多樣，其中有少數(shù)關于CFTR(cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator)鈣激活氯離子通道在肺泡液體清除中的報道。也有容積調控性氯通道對細胞正常生理功能的維持作用。但是尚未有足夠的人重視起其在急性肺損傷過程中的作用。
　　 本課題選擇了TMEM16A作為研究的對象。因為TMEM16A是2008

5、年才被正式報道的一種新穎的鈣激活氯離子通道，主要有以下幾個特點：1、作用眾多。如對小鼠氣道的形成，減少氣道粘液分泌，信號傳導等方面均有作用，并且兼有容積調控功能。2、人體內含量豐富，并且在多種組織表達。3、有可用的特異阻斷劑，如尼氟滅酸(NFA)，這是很多實驗必備的條件。4、小鼠基因序列與人同源性高，達91％。5、具有其它TMEM16家族蛋白不具有的分子特性。6、有其它氯離子通道研究作為基礎。7、潛在的鈣激活氯通道的分子基礎。
　

6、　 有文獻證明氯離子通道在急性肺損傷時對肺泡液體清除存在著一定作用，而且在前期預實驗當中發(fā)現(xiàn)：TMEM16A在急性肺損傷過程中，其表達量會因疾病受到影響。因此選擇復制了兩種本實驗室相對成熟的急性肺損傷大鼠模型：大腸桿菌(E.coli)氣道注入和脂多糖(LPS)尾靜脈注射模型，分別模擬肺內外源性急性肺損傷過程。比較兩種肺損傷發(fā)病機制以及不同肺損傷模型中肺組織TMEM16A的組織含量表達差異。
　　 方法：選取清潔級健康雄性Spr

7、ague Dawley(SD)大鼠18只，體重250±10g，將其隨機分為三組：正常對照組，LPS干預組，Ecoli干預組，各組均為6只。LPS組：經(jīng)尾靜脈注射LPS(8mg/kg)，4小時后取材。E.coli組：大腸桿菌混懸液（3ml/kg）（濃度109級）氣管內緩慢均勻滴入，24小時后取材。造模成功后將動物以10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，固定在手術臺上。股動脈放血處死后立即開胸取新鮮肺組織（右肺下葉，于冰上操作），取材

8、后立即放于已標記好的凍存管中，轉移至-80℃冰箱中保存，留待蛋白印跡（Westem blot，以下簡稱WB）用。取右肺上葉肺組織用于濕/干重比(W/D)檢測。取右肺中葉肺組織用10％中性福爾馬林溶液固定，留做病理及免疫組織化學檢查。分離出氣管，做“T”字型倒切口，行氣管插管。用無菌生理鹽水4ml行支氣管肺泡灌洗術，使灌洗液在肺內停留20秒左右，期間反復搖晃手術臺，使灌洗液盡可能滲透至肺泡腔內。如此反復3次，回收灌洗液，過濾后離心(120

9、0rpm，10min)。上清液-80℃保存，留待蛋白含量測定。
　　 結果：
　　 1、WB結果正常組（1.599±0.142）及LPS組(1.652±0.036)之間無統(tǒng)計學差異，而大腸桿菌組(1.149±0.125)相比其它兩組有明顯下降。
　　 2、病理結果光鏡下肺組織病理評分LPS組(11.33±1.37)與E.coli組(11.83±0.75)均明顯高于正常組。兩模型組之間無統(tǒng)計學差異。
　　

10、3、免疫組化可見肺血管平滑肌細胞及肺泡上皮細胞特異性染色。
　　 4、肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量測定顯示LPS組(1.15±0.12)與大腸桿菌組(0.91±0.29)均高于正常組；肺濕干比顯示兩模型組LPS組(5.35±0.45)與大腸桿菌組(4.61±0.19)均明顯高于正常組。
　　 結論：
　　 1、本實驗成功的復制了大腸桿菌及LPS誘導的肺內外源性急性肺損傷模型，此模型穩(wěn)定性及預見性好，成功率高，易

11、操作，是目前急性肺損傷研究較好的模型。也是本實驗室成熟的實驗模型。病理結果示造模成功。且兩模型組之間病理損傷評分一致，可以做組間對比。
　　 2、免疫組化證明在肺泡上皮細胞以及肺血管平滑肌細胞上存在所研究蛋白TMEM16A。
　　 3、肺泡液蛋白滲出增加，肺濕干比重升高，說明肺泡液體清除率在急性肺損傷時是下降的，這一點在內源性急性肺損傷時與氯離子通道表達量的變化是一致的。
　　 4、TMEM16A在大腸桿菌所致急