1、食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和死亡率高等特點,河南省是其高發(fā)省份。目前治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等,對中、晚期食管癌均有一定的局限性且療效不能令人滿意。因此,尋求食管癌生物治療的新靶點和新途徑已成為近年來的研究熱點之一。
　　 近年來,研究發(fā)現(xiàn)很多在胚胎發(fā)育、組織分化過程中起調(diào)控作用的信號通路同樣在腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要的作用,其中包括Sonic hedgehog信號通路、EGFR信號

2、通路、TGF-β信號通路、Wnt信號通路等。Smoothened(Smo)蛋白是Sonic hedgehog信號通路中的信息轉(zhuǎn)換器,能夠把細胞外的SHh信號轉(zhuǎn)換成細胞內(nèi)的Glil信號,從而啟動細胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄,對Sonic hedgehog信號通路具有激活作用。正常組織和細胞中,Smo不表達或低表達,維持細胞正常代謝需要。當Smo過表達時,可異常激活Hedgehog通路,產(chǎn)生大量促癌因子,使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和惡變。研究表明,Smo在一些人

3、類腫瘤,如惡性膠質(zhì)瘤、胃癌、肝細胞癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、惡性淋巴瘤、基底細胞癌等組織中高表達。有學者認為,Smo有望成為腫瘤基因治療的新靶點和早期診斷、評估預后的新指標。
　　 Gli基因家族最初是在人類惡性膠質(zhì)瘤中擴增Glil時被確認的。人類有三種Gli同源基因:Gli1、Gli2、Gli3。Gli1基因編碼1106個氨基酸的蛋白質(zhì),定位于染色體12q13,作為脊椎動物的轉(zhuǎn)錄效應器,穿梭于細胞漿和細胞核之間,將

4、轉(zhuǎn)錄信號由細胞漿傳遞進細胞核。Gli1蛋白不能被蛋白酶所水解,只能以全長的狀態(tài)存在于細胞質(zhì)內(nèi),通過自身不同長度對細胞核內(nèi)下游基因起轉(zhuǎn)錄或抑制作用,所以,Gli1蛋白只具有轉(zhuǎn)錄激活作用。另有研究表明,使用RNA干擾技術(shù)抑制胃癌細胞系中Smo表達的同時可降低Gli1的表達量。有關在食管癌中使用RNAi技術(shù)抑制Smo、Gli1表達的研究迄今尚未見文獻報道。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種在動植物中

5、普遍存在的通過雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)在mRNA水平上誘導特異性序列基因沉默的過程。dsRNA進入細胞后,在dsRNA核酸酶(Dicer)作用下,被裂解成21bp-23bp的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA與一種多聚核酸酶復合物結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silence complex,RISC),RISC同與siRNA互補

6、的mRNA結(jié)合,發(fā)揮RNA酶作用酶解mRNA,屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)的一種。目前應用RNAi技術(shù)在細胞信號傳導通路、抗病毒、抗腫瘤等領域的實驗研究廣泛深入開展,標志著RNAi必將成為研究基因功能不可或缺的工具。
　　 本研究應用RNAi技術(shù)特異性抑制食管癌EC9706細胞中Smo表達,采用免疫細胞化學、原位雜交等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后EC9706細胞中Sm

7、o、Gli1蛋白及mRNA的表達情況,應用Boyden chamber體外侵襲實驗觀察轉(zhuǎn)染前后細胞侵襲力的變化,為臨床應用RNAi技術(shù)靶向治療食管癌提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1.人食管癌EC9706細胞株由中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈。
　　 2.食管癌EC9706細胞的培養(yǎng):食管癌EC9706細胞于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10％胎牛血清,青霉素100U／ml,鏈霉素1

8、00U／ml),37℃、5％CO2孵箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。
　　 3.siRNA的體外合成、鑒定及篩選:首先設計合成siRNA的寡核苷酸模板,5'端為T7啟動子序列,在體外和T7 RNA聚合酶特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄出目的siRNA。分別合成兩段特異性siRNA和一段無義對照siRNA,應用4％瓊脂糖凝膠電泳,以定量模板DNA為參照,測定siRNA的長度和濃度；通過預實驗篩選出一段干擾效果較好的特異性siRNA。
　　 4.轉(zhuǎn)染:應用Li

9、pofusinX脂質(zhì)體將siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細胞。
　　 5.應用免疫細胞化學SP法,檢測轉(zhuǎn)染前后各實驗組、對照組中Smo和Gli1蛋白的表達情況。
　　 6.應用細胞原位雜交技術(shù),檢測轉(zhuǎn)染前后各實驗組、對照組中Smo和Gli1mRNA的表達情況。
　　 7.應用Boyden chamber體外侵襲實驗觀察轉(zhuǎn)染前后細胞侵襲力的變化。
　　 8.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,

10、計量資料采用均數(shù)±標準差((X)±S)表示；兩組均數(shù)的比較用t檢驗(t-test)；兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)；以α=0.05為顯著性標準。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功體外合成兩條siRNA,長度均為21bp。
　　 2.EC9706細胞形態(tài)學變化:Smo特異性siRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞后,可見細胞逐漸變圓,折光增強,繼而開始皺縮,漂浮。
　　 3.免疫細胞化學結(jié)果:150ng

11、／μl、200ng／μl、250ng／μl三種不同濃度的特異性Smo siRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞24h、48h、72h后,Smo、Gli1蛋白表達量均有所降低,其中以250ng／μl轉(zhuǎn)染72h的抑制效應最為明顯,各實驗組與細胞對照組(不轉(zhuǎn)染)、空白對照組(空脂質(zhì)體)、無義對照組(轉(zhuǎn)染無義siRNA)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；每個濃度組內(nèi)隨轉(zhuǎn)染時間增加抑制效應增強,三個時間段兩兩相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05

12、)；每個時間段內(nèi)隨轉(zhuǎn)染劑量增加抑制效應逐漸增強,三種濃度兩兩相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；空白對照組、無義對照組與細胞對照組相比均未表現(xiàn)出對Smo、Gli1蛋白表達的抑制效應,三個對照組兩兩相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 4.原位雜交結(jié)果:150ng／μl、200ng／μl、250ng／μl三種不同濃度的特異性SmosiRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞24h、48h、72h后,Smo、Gli1 mRNA表達

13、量均有所降低,其中以250ng／μl轉(zhuǎn)染72h的抑制效應最為明顯,各實驗組與細胞對照組、空白對照組、無義對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；每個濃度組內(nèi)隨轉(zhuǎn)染時間增加抑制效應增強,三個時間段兩兩相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；每個時間段內(nèi)隨轉(zhuǎn)染劑量增加抑制效應逐漸增強,三種濃度兩兩相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；細胞對照組、空白對照組與無義對照組相比均未表現(xiàn)出對Smo、Gli1 mRNA表達的抑制效應,三個對照組

14、兩兩相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 5.Boyden chamber體外侵襲實驗結(jié)果:Smo siRNA體外轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞后,穿越Matrigel的細胞數(shù)明顯少于細胞、空白和無關對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Smo siRNA可特異性抑制食管癌EC9706細胞中Smo蛋白及mRNA的表達。
　　 2.Smo siRNA在下調(diào)食管癌EC9706