1、菱葉山螞蝗是豆科Leguminosae長(zhǎng)柄山螞蝗屬Podocarpium植物長(zhǎng)柄山螞蝗Podocarpium podocarpum(DC.) Yang et Huang的根、葉或全草，具有發(fā)表散寒、止血功能，主治風(fēng)寒感冒、急性黃疸型肝炎、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、刀傷等。藥理活性篩選方面，課題組前期研究表明菱葉山螞蝗醇提物具有鎮(zhèn)痛、解熱和抗炎作用;化學(xué)成分研究方面，有文獻(xiàn)報(bào)道從其變種尖葉長(zhǎng)柄山螞蝗Podocarpiumpodocarpum(D

2、C.) Yang et Huang var.oxyphyllum(DC.) Yang et Huang中分離得到11個(gè)化合物（包括6個(gè)黃酮、2個(gè)三萜和1個(gè)甾體），還沒有關(guān)于菱葉山螞蝗化學(xué)成分分離及成分活性篩選方面的文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病?；瘜W(xué)藥治療一般采用聯(lián)合用藥，其毒副作用大，療程長(zhǎng)，從天然藥用植物中尋找副作用小治療骨質(zhì)疏松疾病的有效

3、提取物、有效部位及單體化合物已成為研究熱點(diǎn)。目前抗骨質(zhì)疏松作用的研究多從補(bǔ)腎類中藥和富含黃酮的豆科植物著手，天然產(chǎn)物中具有抗骨質(zhì)疏松活性的化合物結(jié)構(gòu)類型主要包括黃酮類、甾體類、苯丙素類、生物堿類等，其中黃酮類化合物抗骨質(zhì)疏松報(bào)道較多。菱葉山螞蝗是豆科蝶形花亞科植物，富含黃酮類化合物，并且菱葉山螞蝗傳統(tǒng)可用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷和刀傷，提示菱葉山螞蝗可能具有抗骨質(zhì)疏松的作用。課題組前期針對(duì)菱葉山螞蝗進(jìn)行了體外抗骨質(zhì)疏松作用初步篩選，結(jié)果

4、顯示粗提物具有良好的體外促成骨細(xì)胞增殖作用。
　　 基于以上原因，本論文對(duì)菱葉山螞蝗全草提取物進(jìn)行了體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松作用研究，并對(duì)全草進(jìn)行了系統(tǒng)的的化學(xué)成分分離鑒定，對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行體外和體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松作用篩選，闡明菱葉山螞蝗抗骨質(zhì)疏松的物質(zhì)基礎(chǔ)。采用分子對(duì)接技術(shù)篩選化合物抗骨質(zhì)疏松的作用靶點(diǎn)，圍繞靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行菱葉山螞蝗抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制探討。
　　 一、菱葉山螞蝗體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松作用篩選
　　 本論文采用大鼠

5、去卵巢致骨質(zhì)疏松模型(OVX)對(duì)菱葉山螞蝗乙醇提物(100mg/kg～300 mg/kg)進(jìn)行預(yù)防骨質(zhì)疏松癥藥效學(xué)研究。取大鼠右側(cè)股骨測(cè)定總骨密度(t-BMD)，采用顯微CT觀察股骨的骨組織尤其是骨小梁形態(tài)并比較相關(guān)計(jì)量學(xué)參數(shù)，以確定有效性;取尿液測(cè)定鈣(Ca)、磷(P)和肌酐(Cr)含量觀察骨Ca、P吸收和流失情況;取血清測(cè)定骨形成相關(guān)指標(biāo)ALP和骨鈣素(BGP)含量、骨吸收相關(guān)指標(biāo)組織蛋白酶K(Cathepsin K)、TRAP和脫

6、氧膠原吡啶交聯(lián)(DPD)含量，探索藥物與骨形成和骨吸收的聯(lián)系;取血清測(cè)定氧化應(yīng)激相關(guān)酶（谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px、超氧化物歧化酶SOD、一氧化氮合酶NOS、丙二醛MDA)的活力，探討藥物可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，醇提物能顯著提高去卵巢大鼠t-BMD，micro-CT直觀反映出醇提物對(duì)去卵巢造成的大鼠股骨骨小梁厚度和數(shù)量減少及連接間隙增大有顯著的改善;血清生化指標(biāo)測(cè)定的結(jié)果表明醇提物對(duì)骨吸收指標(biāo)有顯著抑制作用，對(duì)骨形成指標(biāo)無明顯影響

7、，提示醇提物很大程度上是通過抑制骨吸收起到抗骨質(zhì)疏松作用的;另外，醇提物能夠提高血清中GSH-Px、NOS和SOD酶活力，提示其抗骨質(zhì)疏松作用可能與氧化應(yīng)激機(jī)制有關(guān)。
　　 二、菱葉山螞蝗化學(xué)成分研究
　　 本論文應(yīng)用萃取、硅膠、凝膠、反相柱層析和制備HPLC等多種分離方法和分離材料對(duì)菱葉山螞蝗全草乙醇提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分分離，共計(jì)分離鑒定73個(gè)化合物，其中2個(gè)新化合物（1個(gè)雙黃酮和1個(gè)苯丙素苷酯類化合物）?；衔?/p>

8、類型包括:黃酮類(DP1～25)(11個(gè)異黃酮、9個(gè)異戊烯基黃酮)，苯丙素類(DP26～33)，三萜皂苷和單萜(DP34～40)，甾體(DP41～42)，生物堿類(DP43～46)，酚酸類(DP47～56)，以及其它類化合物(DP57-73)。從正丁醇部位分得了約10 g的山萘苷單體化合物，提示山萘苷是菱葉山螞蝗主要的化學(xué)成分，其大量存在可能是菱葉山螞蝗抗骨質(zhì)疏松的主要藥效物質(zhì)。因此，建立了菱葉山螞蝗中山萘苷HPLC含量測(cè)定方法，并對(duì)菱

9、葉山螞蝗全草、根、莖、葉及其變種尖葉長(zhǎng)柄山螞蝗全草中山萘苷的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，菱葉山螞蝗中山萘苷主要分布在葉中，其含量可達(dá)1.16±0.09％;根和莖中不含山萘苷。變種尖葉長(zhǎng)柄山螞蝗全草中不含山萘苷。提示菱葉山螞蝗植物變種與原種在化學(xué)成分及其含量方面差異較大。
　　 三、菱葉山螞蝗化學(xué)成分體外抗骨質(zhì)疏松作用研究
　　 本論文對(duì)分離得到的18個(gè)黃酮類(DP1～18)化合物進(jìn)行了體外成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的篩選。采用

10、新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞篩選化合物對(duì)成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性和骨結(jié)節(jié)誘導(dǎo)能力的影響;采用成骨細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞經(jīng)1，25-(OH)2-VD3和地塞米松共同誘導(dǎo)得到的成熟破骨細(xì)胞篩選化合物對(duì)破骨細(xì)胞酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性的抑制作用。結(jié)果顯示，12個(gè)黃酮類化合物同時(shí)具有體外促成骨細(xì)胞增殖、提高成骨細(xì)胞ALP活性、促進(jìn)骨結(jié)節(jié)誘導(dǎo)能力以及抑制破骨細(xì)胞TRAP酶的活性。其中2個(gè)化合物（DP3和DP16）均不具有以上活性。

11、r>　　 四、菱葉山螞蝗中山萘苷體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松作用篩選
　　 鑒于菱葉山螞蝗全草具有抗骨質(zhì)疏作用，全草中山萘苷含量高于1％，山萘苷體外又具有成骨和破骨細(xì)胞活性，因此采用大鼠去卵巢致骨質(zhì)疏松模型(OVX)對(duì)山萘苷(8～32 mg/kg)單體化合物進(jìn)行預(yù)防骨質(zhì)疏松癥藥效學(xué)研究。結(jié)果顯示，山萘苷高、中劑量均能顯著提高去卵巢大鼠t-BMD，micro-CT顯示山萘苷對(duì)去卵巢造成的大鼠股骨骨小梁厚度和數(shù)量減少及連接間隙增大有顯著的改善;

12、血清生化指標(biāo)測(cè)定的結(jié)果表明山萘苷對(duì)骨形成指標(biāo)ALP有提高作用，對(duì)骨吸收指標(biāo)均有顯著抑制作用，提示山萘苷兼有促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的作用，但后者占主導(dǎo)地位;另外，山萘苷高劑量組能夠提高血清中NOS和SOD酶活力，提示其抗骨質(zhì)疏松作用可能與氧化應(yīng)激機(jī)制有關(guān)。
　　 五、山萘苷抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制研究
　　 采用分子對(duì)接法尋找山萘苷抗骨質(zhì)疏松的作用靶點(diǎn)。通過SYBYL軟件構(gòu)建山萘苷3D結(jié)構(gòu)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分子力學(xué)優(yōu)化，將優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)文

13、件上傳至藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋潛在的藥物靶點(diǎn)，將與骨質(zhì)疏松有關(guān)的靶點(diǎn)按照打分高低篩選出來后，再應(yīng)用DOCK軟件進(jìn)行正向?qū)域?yàn)證，最終確定藥靶。分子對(duì)接結(jié)果顯示，山萘苷作用靶點(diǎn)是與骨吸收直接相關(guān)的由破骨細(xì)胞分泌的關(guān)鍵酶—Cathepsin K。緊接著，采用體外破骨細(xì)胞驗(yàn)證山萘苷對(duì)Cathepsin K的抑制作用。結(jié)果顯示，山萘苷對(duì)破骨細(xì)胞Cathepsin K有顯著的抑制作用，抑制率達(dá)50％。大鼠去卵巢動(dòng)物試驗(yàn)也顯示山萘苷對(duì)去卵巢大鼠Cath

14、epsin K的升高有明顯抑制作用。以上初步證實(shí)山萘苷抗骨質(zhì)疏松的作用靶點(diǎn)可能是Cathepsin K。檢索文獻(xiàn)，目前Cathepsin K參與骨質(zhì)疏松的信號(hào)通路有NF-κB通路、MAPK通路(包括ERK1/2、P38和JNK)、PI3K/Akt和CN/NFATC通路。采用Western-blot技術(shù)對(duì)p-ERK、p-JNK、p-P38和p-IκB等關(guān)鍵蛋白酶進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示山萘苷對(duì)p-JNK和p-IκB有明顯的下調(diào)作用，說明山萘苷主