1、RASSFlA是定位于腫瘤高頻雜合性丟失區(qū)域3p21.3位點的抑瘤基因，編碼一個微管相關(guān)蛋白。該基因在多種實體瘤組織中因啟動子高甲基化而表達(dá)沉默，是迄今為止在腫瘤組織中甲基化程度最高的基因之一。前期多項研究指出，除了在上皮性腫瘤中發(fā)生甲基化之外，RASSFlA基因在惡性黑色素瘤細(xì)胞中也存在高頻甲基化，提示該基因在黑色素瘤的發(fā)生過程中也可能存在表達(dá)異常。在本研究中，我們首次采用免疫組織化學(xué)及western blot的方法研究了RASSFl

2、A基因在正常皮膚組織、皮膚色素痣以及惡性黑色素瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RASSFlA蛋白在正常皮膚色素細(xì)胞和色素痣細(xì)胞中高表達(dá)，而在惡性黑色素瘤組織中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。RASSFlA蛋白在非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系中有微弱表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系中表達(dá)缺失。該結(jié)果證實了RASSFlA在黑色素瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，強烈提示RASSFlA參與了黑色素瘤的發(fā)生與演進(jìn)過程。
　　 以往關(guān)于RASSF

3、lA基因功能的研究絕大部分都是在上皮性腫瘤中開展的，為了進(jìn)一步探討RASSFlA基因是否參與了惡黑的發(fā)生發(fā)展，我們在RASSFlA基因表達(dá)缺失的惡黑細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染RASSFlA基因，恢復(fù)其表達(dá)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，研究該基因?qū)汉诩?xì)胞生物學(xué)行為的影響。細(xì)胞生長曲線測定結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RASSFlA基因抑制了A375細(xì)胞的生長與增殖能力；平板集落形成實驗表明該基因同時抑制了A375細(xì)胞的克隆集落形成能力；進(jìn)一步采用裸鼠移植瘤的方法證實，

4、穩(wěn)定表達(dá)RASSFlA基因不僅抑制了A375細(xì)胞的體外增殖能力，而且抑制了該細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成移植瘤的能力。以上結(jié)果表明：RASSFlA基因具有抑制惡黑細(xì)胞生長增殖的能力，是一個黑色素瘤抑瘤基因。
　　 腫瘤細(xì)胞的生長與增殖受抑制，通常是通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程或者凋亡過程而實現(xiàn)。為了研究RASSFlA抑制惡黑的機制，我們對細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡進(jìn)行了分析。}tochest33258染色發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)RASSFlA基因的A375細(xì)胞存在細(xì)

5、胞核固縮、濃染，是典型的細(xì)胞凋亡的形態(tài)；通過流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)一步證明，穩(wěn)定表達(dá)RASSFlA的A375細(xì)胞凋亡率增加；細(xì)胞周期進(jìn)程分析結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)RASSFlA基因的A375細(xì)胞停留于G1期的細(xì)胞比例增加，而S期細(xì)胞比例降低，兩者相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明RASSFlA穩(wěn)定表達(dá)引起A375細(xì)胞周期G1.S期阻滯。Westem blot檢測發(fā)現(xiàn)RASSFlA抑制了cyclin D1和磷酸化Rb蛋白的表達(dá)；RASSFlA抑制cyclin

6、 D1蛋白表達(dá)是通過降低其蛋白穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明，RASSFlA是通過同時影響細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期而抑制惡黑細(xì)胞的增殖能力與致瘤性。
　　 為了研究RASSFlA基因穩(wěn)定表達(dá)對A375細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，采用Affimatrix公司全基因組表達(dá)譜芯片篩查受RASSFlA表達(dá)所調(diào)控的差異表達(dá)基因。篩選出受RASSFlA基因調(diào)控黑色素瘤A375細(xì)胞中差異表達(dá)的基因共210個，其中上調(diào)184個，下調(diào)26個基因。為了驗證基因芯片的數(shù)據(jù)

7、的可靠性，采用realtime RT-PCR方法檢測部分差異表達(dá)的基因，結(jié)果表明realtime RT-PCR檢測結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致，說明芯片數(shù)據(jù)可靠。通過生物信息學(xué)分析差異表達(dá)基因的功能歸類，發(fā)現(xiàn)RASSFlA調(diào)控的差異基因功能涉及轉(zhuǎn)錄與信號通路調(diào)控、細(xì)胞生長與增殖調(diào)控、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間粘附、細(xì)胞免疫應(yīng)答等過程，提示RASSFlA可能通過影響這些基因的表達(dá)從而影響A375細(xì)胞相應(yīng)的生物學(xué)過程。
　　 基因芯片篩查

8、發(fā)現(xiàn)RASSFlA基因穩(wěn)定表達(dá)引起細(xì)胞凋亡相關(guān)分子ASK1表達(dá)上調(diào)，結(jié)合前期發(fā)現(xiàn)RASSF1 A穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡，我們認(rèn)為RASSFlA可能是通過影響ASKl的表達(dá)從而促進(jìn)惡黑細(xì)胞凋亡。通過realtime RT-PCR～lJwestem blot檢測證實RASSF1 A轉(zhuǎn)染后ASKl的表達(dá)水平上調(diào)。由于ASKl是JNK、P38 MAPK的上游激酶，我們采用western blot分析了JNK、P38 MAPK的表達(dá)，結(jié)果表

9、明磷酸化P38 MAPK表達(dá)增加，total P38 MAPK表達(dá)水平?jīng)]有改變；在RASSFlA轉(zhuǎn)染細(xì)胞和空載體對照細(xì)胞中，我們沒有檢測到磷酸化的JNK表達(dá)。說明RASSFlA引起ASKl表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了P38 MAPK的活化；western blot分析發(fā)現(xiàn)RASSFlA下調(diào)Bcl2表達(dá)，并引起cytochromeC從線粒體漏出至胞漿，促進(jìn)了caspase3的表達(dá)與活化，說明RASSFlA通過活化P38 MAPK激活線粒體凋亡途徑，是其

10、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機制。在RASSFlA穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞中采用RNAi的方法抑制ASKl表達(dá)，結(jié)果細(xì)胞凋亡率下降，說明RASSFlA促進(jìn)惡黑細(xì)胞凋亡的作用部分依賴于ASKl。
　　 RASSFlA抑制惡黑細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用有可能是通過影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)。采用westem blot分析與增殖、凋亡密切相關(guān)的細(xì)胞信號通路的表達(dá)與活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASSF1A抑制了AKT的磷酸化，并引起其下游mTOR通路的p70S6K與eIF4E磷酸

11、化水平降低，對其總蛋白表達(dá)沒有影響，表明RASSF1A抑制了A375細(xì)胞AKT/mTOR通路的活化。在RASSFlA穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染myc-AKT1質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AKT1可以逆轉(zhuǎn)RASSF1A對凋亡、細(xì)胞周期相關(guān)分子的調(diào)節(jié)，具體表現(xiàn)為：瞬時轉(zhuǎn)染分子myc.AKT1引起RASSF1A/A375細(xì)胞中磷酸化P38 MAPK表達(dá)下調(diào)，而磷酸化eIF4E、Bc12和cycling D1表達(dá)水平上調(diào)，說明過表達(dá)AKT1可以逆轉(zhuǎn)RAS