1、目的:研究Ki-67核心啟動(dòng)子區(qū)域存在的Spl順式作用元件對(duì)Ki-67基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。
　　 方法:以Ki-67啟動(dòng)子質(zhì)粒pGLBK235(-223～+12)為模板,針對(duì)其核心調(diào)控序列的Spl一致性序列(CCCGCC)采取定點(diǎn)突變(CCCGCC→CCTGCC)的方法獲取重組突變體。分別轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人腎癌細(xì)胞(OS-RC-2)、人肺癌細(xì)胞(A549),使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子活性的變化。分別用

2、Spl真核表達(dá)載體pN3-Spl、Spl小干擾Spl SiRNA以及與GC富含序列選擇性結(jié)合的抗腫瘤藥物光神霉素作用于上述細(xì)胞,用細(xì)胞免疫組化檢測(cè)Ki-67蛋白的變化,用RT-PCR檢測(cè)Ki-67mRNA的變化,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)質(zhì)粒pGLBK235啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的變化。
　　 結(jié)果:對(duì)質(zhì)粒pGLBK235(-223～+12)進(jìn)行定點(diǎn)突變后得到的兩個(gè)重組突變體的啟動(dòng)子活性在三種腫瘤細(xì)胞中均有不同程度的降低,其中突變

3、體二(MutB)的啟動(dòng)子活性下降幅度較大,其在Hela、OS-RC-2、A549三種腫瘤細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性分別降至突變前片段BK235的36.9％、26.9％、28.6％。pN3-Spl轉(zhuǎn)染細(xì)胞其Ki-67蛋白與mRNA的量均有增多,與pN3-Spl共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒pGLBK235啟動(dòng)子活性也有不同程度的升高,在Hela、OS-RC-2、A549三種腫瘤細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性分別為未行共轉(zhuǎn)染的BK235的1.68倍、1.34倍、1.83倍。Sp

4、l siRNA以及光神霉素作用過的細(xì)胞其Ki-67蛋白與mRNA的量均有減少,質(zhì)粒pGLBK235啟動(dòng)子活性也有不同程度的降低。其中與Spl siRNA共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒pGLBK235啟動(dòng)子活性在Hela、OS-RC-2、A549三種腫瘤細(xì)胞中分別降至未行共轉(zhuǎn)染的BK235的45.9％、64.5％、46.O％;受到光神霉素作用的質(zhì)粒pGLBK235的啟動(dòng)子活性則隨著藥物濃度的升高呈階梯性降低,其中藥物濃度為500nM時(shí)其活性最低,在Hela

5、、OS-RC-2、A549細(xì)胞分別降至未受藥物作用的BK235的34.7％、44.2％、29.8％。
　　 結(jié)論：Ki-67核心調(diào)控序列(-170～-144)中兩個(gè)Spl一致性序列(CCCGCC)能夠影響Ki-67基因的啟動(dòng)子活性,對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變可使啟動(dòng)子活性降低。Spl真核表達(dá)質(zhì)粒pN3-Spl可以通過增加Spl蛋白的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)Ki-67基因的啟動(dòng)子活性。Spl小干擾Spl-siRNA和抗腫瘤藥物光神霉素可分別通過減少或抑制