1、煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的煙草細菌性病害，主要發(fā)生在溫度較高的熱帶、亞熱帶地區(qū)。近年來我國煙草青枯病菌發(fā)病地區(qū)逐步增加，在各大煙區(qū)均有發(fā)生，青枯病受環(huán)境因素影響較大，在部分年份爆發(fā)式發(fā)生，對煙葉的生產(chǎn)產(chǎn)生毀滅性打擊，對我國的煙草農(nóng)業(yè)產(chǎn)生極大危害。近幾年來，由于氣候等多方面的原因，該病逐步向北方煙區(qū)擴展，在山東、河南、陜西及遼寧等省都有發(fā)生，局部地區(qū)為害較重。
　　煙草青枯病菌在

2、土壤或者堆肥中越冬，不同條件下存活時間差異很大，煙草青枯病是高溫高濕型病害，受溫度和濕度影響很大。因此本實驗探究在不同的環(huán)境條件下青枯病菌的生長繁育狀況，以期探索青枯病青枯病菌的病原數(shù)量與青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)之間的關系本研究利用實時熒光定量PCR技術，設計了兩對煙草青枯病菌的特異性檢測引物，在煙苗移栽后，對煙田中煙草青枯病菌的生物量進行定量檢測，得到土壤中煙草青枯病菌的消長動態(tài)曲線。同時結合當?shù)氐臍鉁睾徒邓?，分析了煙草青枯病的發(fā)病率及

3、病情指數(shù)與病原菌種群數(shù)量之間的關系。主要研究結果如下：
　　1．設計并驗證了引物的特異性?；跓煵萸嗫莶【鷉lagellin(fliC) gene核苷酸序列保守區(qū)段，設計了煙草青枯病菌的特異性引物Flic-f1/Flic-r1、Flic-f2/Flic-r2，采用CTAB法提取煙草青枯病菌的DNA，利用常規(guī)的PCR擴增，得到200bp左右的兩條目的片段。和從青枯病菌發(fā)病土壤中分離得到的其他病菌以及實驗室培養(yǎng)的其他菌株DNA為模板進

4、一步PCR檢測。電泳結果顯示只有煙草青枯病菌能夠得到目的片段，其他菌株DNA均未得到目的片段，驗證了所設計引物的特異性，后續(xù)實驗采用Flic-f1/Flic-r1。
　　2．優(yōu)化了常規(guī)PCR和Real-time PCR的反應條件，并檢測了引物的靈敏度。在48℃-62℃之間分別在常規(guī)PCR和基于SYBR Green染料的Real-time PCR進行最適溫度的優(yōu)化，實驗驗證Flic-f1/Flic-r1在57.7℃得到最佳的PCR結

5、果。10倍梯度稀釋所提取的青枯病菌的標準DNA，經(jīng)常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR檢驗，結果顯示常規(guī)PCR檢測下限為1.0×10-4ng/μL，試試熒光定量PCR檢測下限為1.0×10-5ng/μL。
　　3．繪制了Ct值與煙草青枯病菌DNA濃度對數(shù)的標準曲線。以提取的青枯病菌的標準DNA10倍濃度梯度稀釋為模板，使用Bio-Rad-iQ5進行實時熒光定量PCR擴增。根據(jù)軟件設置，得到標準曲線。結果顯示，以ct值15-30為準，決定

6、系數(shù)為0.998，擴增效率為99.6％，線性范圍可達個6個數(shù)量級，溶解峰單一，無引物二聚體產(chǎn)生。實驗證明該標準曲線能用于土壤中的煙草青枯病菌定量檢測。
　　4．繪制田間煙草青枯病菌的病情指數(shù)變化曲線，探究了溫度和降水對煙草青枯病菌的數(shù)量影響之間關系。在三地六點分別五點觀測取樣，記錄了發(fā)病率，同時進行了病情指數(shù)的計算，并且利用熒光定量PCR技術測算土壤中的實時青枯菌量，結合當?shù)貧庀笳就奖O(jiān)測的氣象資料，繪制了氣象變化中降水和溫度的變