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1、目的:探討蛞蝓多糖的最佳提取條件,觀察蛞蝓多糖(Limax polysaccharide)體內(nèi)外抗乙型肝炎病毒(HBV)的效果,為臨床開(kāi)發(fā)新的抗病毒藥物提供理論依據(jù)。 方法:蛞蝓,當(dāng)?shù)匾巴獠杉b定。采用水提法提取蛞蝓多糖,以多糖含量為指標(biāo),從醇沉濃度、浸提溫度、浸提比和浸提時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)選試驗(yàn)。根據(jù)優(yōu)選工藝提取出的粗多糖經(jīng)Sevag法除蛋白、活性炭脫色,透析法除小分子物質(zhì)后得蛞蝓多糖純品,采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖含
2、量以備用。以HepG2(HBV-DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞)的2.2.15細(xì)胞株為模型,拉米呋啶為陽(yáng)性對(duì)照,研究蛞蝓多糖體外抗HBV活性。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的蛞蝓多糖溶液進(jìn)行混合培養(yǎng),通過(guò)四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色分析法檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒性,9d后用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的HBsAg和HBeAg分泌水平,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)液中的HBV-DNA含量,作為藥物抗HBV的觀察指標(biāo),并與抗HBV藥物拉米呋啶進(jìn)行對(duì)照研究
3、,對(duì)蛞蝓多糖體外抗HBV作用進(jìn)行評(píng)價(jià);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用先天感染鴨乙肝模型,分設(shè)生理鹽水模型對(duì)照組、拉米呋啶組、蛞蝓多糖低、中、高3個(gè)劑量組,每組8只雛鴨均以20mg/(kg·d)灌胃給藥10d。斑點(diǎn)雜交法觀察用藥前與用藥后5d、10d及停藥后5d血清中DHBV-DNA表達(dá),對(duì)蛞蝓多糖體內(nèi)抗HBV的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果:正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的蛞蝓多糖最佳提取工藝為醇沉濃度70%,浸提溫度60℃,浸提比1:2,浸提時(shí)間4h。體外實(shí)驗(yàn)表明:蛞蝓
4、多糖在1mg/ml濃度以下對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性;蛞蝓多糖在所稀釋的各濃度下,對(duì)HBsAg、HBeAg均有抑制作用,最大抑制率分別為56.2%和58.1%; HBsAg、HBeAg的治療指數(shù)分別大于19.98%、22.78%。蛞蝓多糖可抑制HBV-DNA的復(fù)制(P<0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明蛞蝓多糖不同劑量組對(duì)DHBV均有一定地抑制作用。其中蛞蝓多糖的中、高劑量組于用藥后第Sd血清DHBV-DNA的A490值為0.66±0.14、0.73±0.26
5、,第10d為0.47±0.18,0.54±0.10與生理鹽水對(duì)照組1.61±0.54、1.20±0.51比較明顯降低。蛞蝓多糖的中、高劑量組對(duì)DHBV-DNA的抑制率于用藥后第5d為24.14%、23.96%,第10d為45.98%、43.75%,與生理鹽水對(duì)照組相比明顯提高。 結(jié)論:優(yōu)選的蛞蝓多糖水提醇沉工藝經(jīng)濟(jì),穩(wěn)定,可行。蛞蝓多糖在體內(nèi)、外均具有抗乙肝病毒作用。本研究為進(jìn)一步深入研究多糖類(lèi)藥物的生物學(xué)活性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),亦
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