1、研究背景和目的：
　　 膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率、病死率最高的一種原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有侵襲性生長(zhǎng)的特性，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且多為致命性。雖然目前臨床上采取手術(shù)、放療、化療、免疫等手段進(jìn)行綜合處理，膠質(zhì)瘤的診治已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但是腦膠質(zhì)瘤的總體治療效果仍然非常差，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，也缺乏特異性治療藥物。新近的研究表明針對(duì)某些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子靶點(diǎn)靶向治療藥物的研制是提高惡性腫瘤整體療效的重要手段之一。Notch信號(hào)通路在

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等過程起到?jīng)Q定作用，該途徑的異常激活與包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境的平衡進(jìn)行的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過程，受一系列凋亡相關(guān)基因的調(diào)控。在此過程中Notch信號(hào)及其下游效應(yīng)物發(fā)揮了重要作用，然而目前Notch信號(hào)途徑的精確調(diào)控作用并未闡明，特別是Notch信號(hào)異常激活對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，以及Notch信號(hào)異?；罨髮?duì)下

3、游靶基因及凋亡過程的作用并不明確。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞株，并分別加入Notch信號(hào)激活劑rhNF-κB和抑制劑DAPT，觀察rhNF-κB和DAPT對(duì)U87細(xì)胞增殖和凋亡過程的影響，初步探討Notch信號(hào)系統(tǒng)在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系增殖與凋亡過程中的調(diào)控作用及其可能機(jī)制，為分子水平治療人腦膠質(zhì)瘤、抗腫瘤藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 研究?jī)?nèi)容和方法：
　　 1、人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-8

4、7 MG細(xì)胞株的培養(yǎng)：
　　 U87細(xì)胞在含10％FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，置于37℃、5％CO2潮濕的恒溫箱中生長(zhǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分成3組，分別為rhNF-κB組、DAPT組以及空白對(duì)照組，培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
　　 2、Notch信號(hào)對(duì)U87細(xì)胞增殖和凋亡過程的影響
　　 臺(tái)盼藍(lán)染色法和MTT法測(cè)定rhNF-κBT和DAPT作用于U87細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響，倒置相差顯微

5、鏡下觀察U87細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 3、Notch信號(hào)調(diào)控U87細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制
　　 RT-PCR檢測(cè)各組U87細(xì)胞Notch1、Hes1、Bcl-2基因的表達(dá)，免疫熒光染色技術(shù)、Western Blot分別檢測(cè)各組蛋白的表達(dá)，測(cè)量各自的總灰度值，定量比較分析各組蛋白相對(duì)灰度值。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)均采用mean±SD表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0

6、進(jìn)行單因素方差分析，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功培養(yǎng)了人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-87 MG細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果表明Notch1及Notch信號(hào)通路下游的靶基因Hes1在U87細(xì)胞株中均有表達(dá)，提示Notch1/Hes1信號(hào)通路在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在。
　　 2、Notch信號(hào)對(duì)U87細(xì)胞增殖和凋亡過程的影響
　　 MTT檢測(cè)結(jié)果表明，培養(yǎng)

7、24、48、72、96 h后，rhNF-κB組細(xì)胞A值分別為0.185±0.007、0.398±0.012、0.735±0.015、1.083±0.031，DAPT組分別為0.102±0.003、0.130±0.004、0.161±0.006、0.194±0.003，對(duì)照組分別為0.167±0.005、0.265±0.008、0.496±0.011、0.737±0.016，與對(duì)照組相比，rhNF-κB組細(xì)胞有較高的活力，DAPT組和對(duì)照

8、組的細(xì)胞活力較差，發(fā)生了不同程度的凋亡(P<0.05)。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rhNF-κB組、DAPT組與對(duì)照組細(xì)胞的總凋亡率分別為0.96％±0.17％、26.51％±3.74％、8.76％±1.4％，與對(duì)照組相比，DAPT組細(xì)胞凋亡明顯，而rhNF-κB組細(xì)胞凋亡較少，差異有顯著性意義(P<0.05)。
　　 3、Notch信號(hào)調(diào)控U87細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制
　　 RT-PCR、免疫熒光、Western-blot檢

9、測(cè)rhNF-κB組、DAPT組與對(duì)照組細(xì)胞Notch1、Hes1、Bcl-2均有表達(dá)，其中Notch1 mRNA及其蛋白表達(dá)量分別為0.974±0.110和0.910±0.082、0.263±0.054和0.302±0.09、0.642±0.072和0.578±0.101，Hes1 mRNA及其蛋白表達(dá)量分別為0.833±0.106和0.896±0.145、0.241±0.047和0.423±0.090、0.402±0.088和0.69

10、6±0.115，Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)量分別為0.230±0.075和0.726±0.113、0.098±0.024和0.252±0.064、0.151±0.052和0.503±0.092。與對(duì)照組相比，rhNF-κB誘導(dǎo)組細(xì)胞各組基因表達(dá)量增加，DAPT組表達(dá)較少。通過Western Blot檢測(cè)，rhNF-κB誘導(dǎo)以后，Notch下游靶基因Hes1和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯增多，DAPT組表達(dá)明顯減少(P均<0.05)

11、，說明rhNF-κB能促使U87細(xì)胞逃避凋亡，DAPT則作用相反，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1、Notch1信號(hào)途徑在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中存在，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、存活過程中發(fā)揮重要作用，rhNF-κB誘導(dǎo)后激活Notch信號(hào)，DAPT誘導(dǎo)后抑制。
　　 2、Notch1信號(hào)在人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株增殖凋亡過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，rhNF-κB誘導(dǎo)后激活Notch信號(hào)，促進(jìn)U87細(xì)胞增殖，逃避凋亡；