1、第一部分丙炔苯丙胺通過上調抗氧化蛋白NQO1表達保護1-甲基-4-苯基吡啶離子所致PC12細胞損傷
　　 目的:本部分研究旨在帕金森?。≒D）的PC12細胞模型中證實丙炔苯丙胺的神經保護作用，并對其保護機制進行初步探索。
　　 方法:應用1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）處理PC12細胞制備PD的細胞模型。采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT 法）、細胞乳酸脫氫酶（LDH）釋放量檢測、活性氧蔟（ROS）含量檢測、四唑氮藍

2、/甘氨酸鹽法行醌結合蛋白檢測、Western Blots等方法檢測丙炔苯丙胺對MPP+所致PC12細胞損傷的保護作用，初步探索丙炔苯丙胺是否通過間接的抗氧化作用發(fā)揮細胞保護效應。
　　 結果:MTT 法和LDH 釋放量檢測均顯示，不同濃度丙炔苯丙胺預處理可以顯著減輕MPP+導致的PC12細胞損傷。ROS 含量測定以及四唑氮藍/甘氨酸鹽法醌蛋白濃度檢測的結果顯示，不同濃度丙炔苯丙胺預處理明顯地逆轉了MPP+導致的氧化應激標志物增高

3、。Western blots 檢測細胞內輔酶Ⅰ醌類氧化還原酶1（NQO1）蛋白表達及二氯靛酚反應法測定NQO1 活性的結果顯示，不同濃度的丙炔苯丙胺可以導致該抗氧化蛋白的表達量和酶活性均呈現出劑量依賴式的增高。另外，LDH 釋放量檢測結果顯示，雙香豆素抑制NQO1后，丙炔苯丙胺對細胞的保護作用被逆轉了。
　　 結論:丙炔苯丙胺可以通過上調抗氧化蛋白NQO1的表達和活性，減少氧化應激損傷標志物的生成，發(fā)揮對MPP+所致的PC12細

4、胞損傷的保護作用。
　　 第二部分丙炔苯丙胺通過促進Nrf2 核轉位介導PC12細胞抗氧化蛋白NQO1表達和活性增高
　　 目的:驗證丙炔苯丙胺是否通過促進核因子紅系2 相關因子2（Nrf2）核轉位介導PC12細胞抗氧化蛋白NQO1表達和酶活性增高。
　　 方法:應用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取PC12細胞的胞漿胞核蛋白，再采用Western blots 技術檢測胞漿胞核中Nrf2的蛋白含量變化；采用

5、Nrf2 小分子干擾RNA（SiRNA）轉染技術，進一步驗證Nrf2在丙炔苯丙胺誘導NQO1 酶活性上調過程中的作用。
　　 結果:Western blots 結果表明，在MPP+的單獨處理下，PC12細胞胞漿和胞核的Nrf2 含量都出現了減少。而丙炔苯丙胺預處理可以有效地減少胞漿內的Nrf2 含量，增加核內Nrf2的含量，且其胞漿內Nrf2的相對表達水平比MPP+單獨處理時還要低，差異均有統(tǒng)計學意義。在轉染了Nrf2 SiRN

6、A的PC12細胞中，NQO1的活性出現了明顯降低。另外，在Nrf2基因被沉默后，丙炔苯丙胺所導致的NQO1 酶活性上調也消失了。
　　 結論：丙炔苯丙胺所導致的抗氧化蛋白NQO1 酶活性增強是通過促進Nrf2 核轉位，從而驅動NQO1 轉錄增強這一途徑完成的。
　　 第三部分 Akt和Erk 信號通路在丙炔苯丙胺抗氧化應激介導的PC12細胞保護機制中的作用
　　 目的：本部分研究旨在探索丙炔苯丙胺促進Nrf2 核

7、轉位的上游激酶調控通路，并觀察丙炔苯丙胺對B 型單胺氧化酶（MAOB）的抑制作用是否也參與了Nrf2的激活過程。
　　 方法：應用Western Blots 方法檢測PC12細胞中Akt和細胞外信號調節(jié)激酶（Erk）等激酶的磷酸化水平變化，并應用各種激酶抑制劑處理PC12細胞觀察各個激酶對Nrf2和NQO1的調控作用。另外，我們應用MAOB和Nrf2 SiRNA 轉染，來分析丙炔苯丙胺對MAOB 抑制作用是否影響了Nrf2 介導

8、的抗氧化反應。
　　 結果：經過Western blots 法檢測發(fā)現，丙炔苯丙胺處理PC12細胞可以誘導Akt和Erk的磷酸化水平呈時間依賴性增高。另外，丙炔苯丙胺介導的Nrf2 核轉位和NQO1表達增高被可以被PD98059 部分阻斷，而PI3K的抑制劑LY294002 幾乎完全地取消了丙炔苯丙胺導致的Nrf2 核轉位和NQO1表達增高。對SiRNA 轉染的PC12細胞的ROS測定表明，MAOB基因沉默可以使ROS 含量出現