1、體細胞雜交技術能夠克服有性雜交不親和等障礙，產(chǎn)生多種多樣的有性雜交無法實現(xiàn)的作物新類型。目前，體細胞雜交育種已在多種植物中獲得成功。本實驗室成功的進行了小麥與多種禾草的體細胞雜交，并在小麥與長穗偃麥草的對稱與不對稱體細胞雜交中分別獲得了長穗偃麥草/小麥漸滲系和小麥/長穗偃麥草漸滲系。通過對小麥/長穗偃麥草漸滲系的篩選培養(yǎng)，從其后代中選育出一系列耐鹽、耐旱新品種和高產(chǎn)、優(yōu)質的小麥新品系。對小麥體細胞雜交機制進行深入研究將有助于體細胞雜交技

2、術在小麥育種中的應用，但是目前尚無相關報道。本實驗對小麥體細胞雜交早期供體染色質消減與漸滲機制進行了系統(tǒng)的研究，闡明了小麥體細胞雜種中供體染色質消減的時期及方式，探討了供體與小麥親緣關系及射線劑量對小麥體細胞雜種中供體染色質消減和漸滲的影響；通過混合小麥與兩種不同親緣關系供體的對稱體細胞雜交，首次獲得了小麥與早熟禾的體細胞雜種，揭示了小麥雜種的植株再生與親本染色質互補現(xiàn)象，并探討了組織培養(yǎng)及雜交過程中的甲基化模式變化。此外，通過對小麥與

3、長穗偃麥草的偏草型雜種及后代的分析，闡明了雜種小麥染色體的存在方式；探討了雜種中小麥染色體的消減現(xiàn)象。 主要研究結果如下： 1 小麥體細胞雜交早期雜種細胞中供體染色質的消減方式 小麥與四種禾草(長穗假麥草Agropyronelongatum(Host)Neviski、簇毛麥HaynaldiavillosaL.、早熟禾PoaannuaL.、玉米ZeamaysL.)體細胞雜交早期融合材料的GISH分析表明：雜種中供體

4、染色質主要以微核的形式在細胞間期發(fā)生消減，同時還存在少量其它的消減方式，如有絲分裂后期形成微核、多核體中形成微核以及雙親核分離等現(xiàn)象。此外，在簇毛麥的體細胞雜種中發(fā)現(xiàn)供體染色質以落后染色體及染色體橋的形式存在。分析發(fā)現(xiàn)雙親核分離的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在小麥與遠緣禾草早熟禾和玉米的雜交組合5-7天的材料中，而在近緣禾草與小麥的雜交中很少出現(xiàn)，表明親緣關系對小麥體細胞雜交中供體染色質的消減具有明顯的影響。 2 小麥體細胞雜交早期雜種細胞中供

5、體染色質消減與漸滲發(fā)生的主要時期 小麥與簇毛麥及早熟禾γ-ray不對稱體細胞雜交分析發(fā)現(xiàn)：雜交后5-7天供體染色質的消減率與漸滲率明顯高于雜交后30天；融合后30天供體染色質的消減率與漸滲率均低于10％。由此可見，小麥體細胞雜交過程中供體染色質消減與漸滲主要發(fā)生在雜交后30天以內，尤其是雜交后5-7天。此外，在小麥與四種禾草的對稱與UV不對稱體細胞雜交中，雜交后5-7天供體染色質的漸滲率與消減率均明顯高于12-15天，這進一步表

6、明小麥體細胞雜交中供體染色質的消減與漸滲主要發(fā)生在雜交早期。 3 供體與小麥的親緣關系對小麥體細胞雜交早期雜種細胞中供體染色質消減與漸滲的影響 通過對小麥與近緣禾草長穗偃麥草、簇毛麥以及遠緣禾草早熟禾、玉米的對稱與不對稱體細胞雜交(UV1min和UV2min)的比較分析發(fā)現(xiàn)，供體與小麥的親緣關系對供體染色質的漸滲率具有非常明顯的影響。親緣關系近，則雜種中供體染色質的漸滲率高；親緣關系遠，則雜種中供體染色質的漸滲率低。此外

7、，供體與小麥的親緣關系與雜種中供體染色質的消減率的變化也具有一定的規(guī)律性：親緣關系近，則雜種中供體染色質的消減率低；親緣關系遠，則雜種中供體染色質的消減率高。但是在長穗假麥草的組合中供體染色質的消減率均很高，如UV1min的劑量組合中，5-7天的消減率為50.4％，12-15天的為37.2％，明顯高于簇毛麥的消減率(37.0％和22.7％)。這表明：近緣供體的倍性及染色體組的大小也可以影響小麥體細胞雜交中供體染色質的消減率。 4

8、 射線劑量對小麥體細胞雜交早期雜種細胞中供體染色質的消減與漸滲的影響 通過對小麥與四種禾草不對稱體細胞雜交中供體染色質消減與漸滲的比較分析表明：小麥體細胞雜交中供體染色質的消減與漸滲受射線劑量的影響。在一定的劑量范圍內，供體染色質的漸滲率隨著射線劑量的增加而升高，供體染色質的消減率隨射線劑量的增加而降低。當射線劑量超出一定范圍時，如早熟禾γ-ray不對稱雜交10000rad劑量組合中，隨著射線劑量的增加，供體染色質的漸滲率明顯降

9、低，而消減率大幅升高。 5 供體與小麥的親緣關系對混合小麥體細胞雜種不對稱程度的影響 混合小麥(cha9和176)與簇毛麥及早熟禾的對稱體細胞雜交獲得了不對稱程度不同的體細胞雜種，并再生大量雜種植株。對兩個組合體細胞雜種的GISH分析表明：小麥/簇毛麥體細胞雜種中，簇毛麥染色體主要以整條的形式存在，同時有1-2個簇毛麥染色體片段：而小麥/早熟禾的體細胞雜種中，沒有發(fā)現(xiàn)早熟禾的整條染色體，其染色質呈點狀散布在雜種染色體上。

10、小麥/早熟禾體細胞雜種的不對稱性遠遠高于小麥/簇毛麥體細胞雜種。由此可見，供體與小麥親緣關系越遠，小麥體細胞雜種的不對稱程度越高。 6 體細胞雜種再生與親本染色質的互補 以含有18S-5.8S-26SrDNA特異序列的pTa71質粒為探針，對同一基因型的愈傷組織(濟南177)和懸浮細胞系(cha9)混合小麥親本及體細胞雜種進行了FISH分析。首次發(fā)現(xiàn)了混合小麥中不同的NORs區(qū)：cha9保留了親本小麥中5條染色體上的5個

11、信號，而176僅保留了2條染色體上的2個信號；cha9和176各自含有小麥濟南177所沒有的特異NORs區(qū)信號。在早熟禾雜種16H中檢測到混合小麥各自特異的NORs區(qū)信號，直觀的揭示了混合小麥在雜種染色體組成上的互補現(xiàn)象。通過對雜種NORs區(qū)信號及雜種表型的分析表明雜種存在明顯的混合小麥再生互補現(xiàn)象。核基因組SSR分析也證實了這一點?；旌闲←溂霸缡旌腆w細胞雜種4H的MSAP分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過長期的繼代培養(yǎng)，混合小麥發(fā)生了大量的甲基化模式改變

12、，有大量位點發(fā)生甲基化。雜種植株再生過程中也有甲基化模式的改變，但明顯低于混合小麥。表明甲基化模式變化與組織培養(yǎng)的時間有關。雜種4H愈傷組織與cha9和176相比，甲基化模式變化明顯不同。與小麥177相比，雜種植株再生時，體細胞雜種中甲基化模式變化得到了明顯的恢復，包括5.88％的甲基化位點和3.35％的去甲基化位點，表明體細胞雜交中的再生互補與表觀遺傳變化相關。 7 對稱體細胞雜交中小麥染色體的消減與漸滲 染色體分析發(fā)

13、現(xiàn)小麥與長穗偃麥草偏草型體細胞雜種染色體數(shù)目與長穗偃麥草類似，對R0粗雜種植株部分PMC的GISH及FISH分析發(fā)現(xiàn)：小麥染色體在減數(shù)分裂末期Ⅰ時，明顯滯后，停留在赤道板上，與長穗假麥草分離；R2代PMC中僅檢測到3-5個小麥染色體小片段。這表明小麥染色體在雜種進入有性世代或減數(shù)分裂過程中大量消減，并在消減的過程中與長穗偃麥草染色體發(fā)生重組，最終以染色體小片段的方式漸滲進雜種中。對小麥與長穗偃麥草偏草型體細胞雜種的AFLP分析發(fā)現(xiàn)，在R

14、2代雜種中，絕大多數(shù)小麥的基因組發(fā)生消減，在兩個雜種中僅檢測到13條小麥特異條帶，其中9條在雜種中共存，1條僅在粗系雜種存在，其余3條僅在細系雜種中存在；兩個雜種中長穗偃麥草基因組消減頻率分別為9.8％及13.4％。此外，在兩個雜種中還檢測到19條新帶，其中三條僅在細系雜種中出現(xiàn)。這表明體細胞雜種中雙親基因組均發(fā)生了消減，同時伴隨著基因組的重排。對雙親及R1-R3代部分雜種種子進行的HMW-GS分析發(fā)現(xiàn)，雜種后代的HMW-GS帶型主要偏