1、1.目的： 第一部分實驗旨在運用磁珠分選技術(magnetic cell sorting，MACS)分選人多形性膠質(zhì)母細胞瘤U51細胞系中的CD133+和CD133-亞群細胞；比較兩個亞群細胞在增殖、分化及體內(nèi)致瘤性等方面的差異，重點探討CD133+細胞生物學特性；評價CD133作為腦腫瘤干細胞表面標志物的特異性與磁珠分選系統(tǒng)分選腦腫瘤干細胞的效率及特異性。 第二部分實驗的主要目的是研究和比較CD133+細胞亞群與CD1

2、33-細胞亞群耐藥性的差異，并檢測兩個亞群細胞在ABC轉(zhuǎn)運體、DNA修復及抗凋亡基因等表達的差異，初步分析CD133+細胞亞群的耐藥機制。 2.方法： 第一部分實驗通過磁珠分選人多形性膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞系中的CD133+和CD133-細胞亞群，通過流式細胞儀檢測分選的純度和兩個亞群細胞的細胞周期；利用MTT試驗和單克隆形成率實驗檢測兩個亞群細胞的增殖能力；運用免疫熒光檢測CD133+細胞亞群的多向分化能力以及CD1

3、33+細胞增殖形成的BTS的分化情況；最后通過裸鼠移植實驗，檢測兩個亞群細胞在裸鼠體內(nèi)致瘤性的差異。第二部分實驗在第一部分磁珠分選細胞的基礎上，觀察CD133+細胞與CD133-細胞在抗腫瘤藥物作用下形態(tài)學的變化；利用MTT試驗和流式細胞儀檢測CD133+細胞亞群與CD133-細胞亞群對抗腫瘤藥物替尼泊苷、卡莫司汀和順鉑的敏感性；通過RT-PCR方法檢測兩個亞群細胞在ABC轉(zhuǎn)運子(MDRl、BCRP、MRP)、DNA修復基因(MGMT)

4、及抗凋亡(Bcl-2)基因的表達差異。 3.結(jié)果： 第一部分實驗結(jié)果表明，在U251細胞系中只有大約4.5％的CD133+細胞，經(jīng)過磁珠分選后，CD133+亞群細胞的細胞純度可以提高到92.4％；分選后的CD133+細胞接種到含EGF和bFGF的無血清培養(yǎng)基中，具有強大的增殖能力，能增殖形成典型的BTS，而CD133-細胞不具有形成BTS的能力，生長曲線亦顯示CD133+細胞增殖能力明顯高于CD133-細胞；流式細胞儀實

5、驗顯示CD133+細胞的細胞增殖率為40.1％，CD133-細胞的細胞增殖率為30.6％；單克隆形成率實驗顯示CD133+細胞能形成BTS的細胞比率達到78.5％-92.4％，而CD133-細胞僅有0.8-2.4％；分化實驗免疫熒光實驗顯示CD133+細胞能分化為具有GFAP和NeuN成熟表型的腫瘤細胞，且CD133+細胞增殖形成的BTS亦能分化為具有GFAP和NeuN成熟表型的腫瘤細胞；裸鼠致瘤實驗顯示CD133+的致瘤率為71.42

6、％，而CD133-細胞沒有致瘤性。第二部分實驗結(jié)果表明，CD133-細胞在抗腫瘤藥物作用下凋亡形態(tài)學改變明顯，CD133+細胞仍能維持生長；MTT實驗顯示，CD133-細胞對抗腫瘤藥物替尼泊苷、卡莫司汀和順鉑的敏感性明顯高于CD133+細胞；流式細胞儀試驗顯示在中等濃度的替尼泊苷作用下，CD133-細胞的凋亡明顯，并出現(xiàn)明顯的“亞G1峰”，而CD133+細胞并未受到明顯抑制和殺滅；流式細胞儀檢測顯示CD133+細胞內(nèi)的藥物蓄積明顯低于C

7、D133-細胞；RT-PCR.實驗顯示， MDRl、BCRP、MRP、MGMT和Bcl-2表達在CD133+明顯高于CD133-細胞。 4.結(jié)論： U251細胞系中存在少量具有增殖、多向分化與體內(nèi)致瘤能力的CD133+細胞，CD133+細胞是符合腫瘤干細胞定義的細胞亞群；磁珠分選是理想的腦腫瘤細胞分選系統(tǒng)；CD133+是U251細胞系中的耐藥細胞亞群，高表達ABC轉(zhuǎn)運體，DNA修復和抗凋亡基因可能是CD133+細胞耐藥的