1、VEGF對(duì)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的影響及機(jī)制
　　 第一章VEGF對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接及通透性的影響
　　 研究背景：
　　 糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。持續(xù)高血糖環(huán)境引起各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的大量產(chǎn)生在DKD的進(jìn)展和惡化中起著關(guān)鍵作用。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growth fac

2、tor，VEGF)在DKD中的重要作用日益受到重視?，F(xiàn)有研究證實(shí)VEGF在糖尿病早期蛋白尿的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(Glomerular endothelial cells，GEnCs)之間的連接破壞可能是導(dǎo)致腎小球通透性增高，以致蛋白漏出增多的重要機(jī)制之一。緊密連接(tight junction，TJ)是內(nèi)皮細(xì)胞最主要的細(xì)胞間連接之一，維持著內(nèi)皮機(jī)械屏障和通透性，由跨膜蛋白Claudin、

3、Occludin、JAM以及接頭蛋白(adaptor proteins)ZO-1，2，3等組成。這些蛋白與肌動(dòng)蛋白-細(xì)胞骨架連接起來(lái)，共同調(diào)控細(xì)胞之間的連接。研究證實(shí)緊密連接受損可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間的通透性增高，而其受損可能由細(xì)胞連接相關(guān)蛋白表達(dá)量和/或磷酸化的改變，或者是連接蛋白成分位置遷移而引起。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的破壞和通透性的增高，是蛋白尿產(chǎn)生、組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和腎臟病進(jìn)展的重要機(jī)制之一。
　　 研究目的：
　　

4、 探討VEGF對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞間通透性和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的影響。
　　 研究方法：
　　 1.在Transwell小室上培養(yǎng)大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞至融合細(xì)胞單層，經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基靜止2小時(shí)后，在培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度VEGF(0，5，50ng/ml)刺激30min后測(cè)定跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗(Transendothelial electrical resistance，TER)和FITC-BSA漏出率，以檢測(cè)GE

5、nC單層通透性；
　　 2.不同濃度VEGF(0，5，50ng/ml)刺激GEnC30min后，分離細(xì)胞膜和細(xì)胞漿蛋白，Western blotting檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在細(xì)胞內(nèi)的重分布情況；
　　 3.不同濃度VEGF(0，5，50ng/ml)刺激GEnC30min后，免疫熒光法檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在細(xì)胞內(nèi)的破壞和重分布情況。
　　 結(jié)論：
　　 VEGF可

6、以引起腎小球內(nèi)皮緊密連接蛋白ZO-1、Occlu din由細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)重分布，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接破壞，細(xì)胞間通透性增高。
　　 第二章PI3K/Akt信號(hào)通路在VEGF破壞腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中的作用
　　 研究背景：
　　 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性和緊密連接的信號(hào)通路包括蛋白激酶C(PKC)、RhoGTPase、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等。PI3K/Akt信號(hào)通路參與很多重要生物學(xué)過(guò)程

7、的調(diào)控，該通路可以被多種細(xì)胞因子所激活，如VEGF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等。目前研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt參與了細(xì)胞通透性和緊密連接的調(diào)節(jié)。但目前尚缺乏PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的直接證據(jù)。
　　 研究目的：
　　 探討PI3K/Akt信號(hào)通路在VEGF破壞腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性和緊密連接中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.不同濃度VEGF(0，5，50ng/ml)分別刺激腎小球內(nèi)皮

8、細(xì)胞5，15，30，60min后，Western blotting檢測(cè)Akt磷酸化情況；
　　 2.使用PI3K抑制劑LY294002和Wortmannin預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)后，加入50ng/ml VEGF作用30min，分離細(xì)胞膜和細(xì)胞漿蛋白，Westem blotting檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在細(xì)胞內(nèi)的重分布情況；
　　 3.使用PI3K抑制劑LY294002和Wortmannin預(yù)處理腎

9、小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)后，加入50ng/ml VEGF作用30min，免疫熒光法檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在細(xì)胞內(nèi)的破壞和重分布情況；
　　 4.使用PI3K抑制劑LY294002和Wortmannin預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)后，50ng/mlVEGF刺激30min后測(cè)定TER和FITC-BSA漏出率，以檢測(cè)GEnC通透性。
　　 結(jié)論：
　　 阻斷PI3K可以減輕VEGF對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的

10、破壞作用，PI3K/Akt信號(hào)通路參與了VEGF對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和通透性的調(diào)節(jié)。
　　 第三章PI3K/Akt和Rac1信號(hào)通路交互作用在VEGF破壞腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中的作用
　　 研究背景：
　　 Rho GTPases家族蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)中具有重要作用，因而它們被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞屏障功能的重要蛋白。目前研究發(fā)現(xiàn)，小GTPases蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞間通透性的具體機(jī)理非常復(fù)雜，在不同的細(xì)胞種

11、類(lèi)和不同刺激因素作用下，這類(lèi)蛋白的作用各不相同。Rac1在維持和穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞屏障中起著關(guān)鍵作用。有研究表明，Rac1/Cdc42和Rap1維持內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，而RhoA則對(duì)抗這種作用。由于Rac與Rho起著互相拮抗的作用，內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能受損，Rho活性增高，理論上應(yīng)伴隨著Rac1活性降低，但是我們已有的前期研究發(fā)現(xiàn)VEGF引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，不僅導(dǎo)致Rho活性增高，Rac1的活性也被激活。這與上述研究存在矛盾之處。前一章研

12、究我們發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接和通透性，Rac1與PI3K/Akt信號(hào)通路是否存在交互作用尚不清楚，有待我們進(jìn)一步研究。
　　 研究目的：
　　 探討PI3K/Akt和Rac1信號(hào)通路交互作用(Cross-talk)在VEGF破壞腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.使用PI3K抑制劑Wortmannin預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)后，Pull-down as

13、say檢測(cè)VEGF刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞30min后Rac1活性的改變；
　　 2.分別建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)ild type Rac1(WT)、Dominant negative Rac1(DN)、Constitutive activated Rac1(ACT)質(zhì)粒的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，Pull-down assay檢測(cè)Rac1活性；
　　 3.使用PI3K抑制劑Wortmannin預(yù)處理以上三種細(xì)胞1小時(shí)后，檢測(cè)VEGF刺激15mi

14、n后Akt磷酸化情況；
　　 4.使用PI3K抑制劑Wortmannin預(yù)處理以上三種細(xì)胞1小時(shí)后，免疫熒光檢測(cè)VEGF刺激以上三種內(nèi)皮細(xì)胞30min后ZO-1、Occludin在細(xì)胞內(nèi)重分布情況。
　　 5.使用PI3K抑制劑Wortmannin預(yù)處理以上三種細(xì)胞1小時(shí)后，50ng/ml VEGF刺激30min后測(cè)定TER和FITC-BSA漏出率，以檢測(cè)GEnC通透性。
　　 結(jié)論：
　　 VEGF可以

15、通過(guò)PI3K-Akt-Rac1信號(hào)通路對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接起到破壞作用，從而增加細(xì)胞間通透性。
　　 第二部分IgA腎病患者血清IgA1對(duì)足細(xì)胞粘附性的影響及機(jī)制
　　 研究背景：
　　 IgA腎病是亞洲和太平洋地區(qū)最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病，約占腎活檢患者的30％-40％。在我國(guó)約占原發(fā)性腎小球疾病的40％～47.2％。在診斷后在10年內(nèi)約有20％患者會(huì)出現(xiàn)腎功能不全，是引起終末期腎臟疾病的常見(jiàn)原因之一。目前

16、有研究發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患者尿中足細(xì)胞的量與該病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，持續(xù)的足細(xì)胞丟失可促進(jìn)蛋白尿加重、腎小球硬化和腎功能下降。因此，研究糖基化缺陷的IgA1沉積在腎小球系膜區(qū)后如何導(dǎo)致足細(xì)胞的損傷可能為IgA腎病的發(fā)病機(jī)理研究提供另外一個(gè)視角。
　　 目的：
　　 觀(guān)察IgA腎病患者血清IgA1對(duì)小鼠足細(xì)胞粘附性及整合素連接激酶的影響及其機(jī)制
　　 研究方法：
　　 收集符合標(biāo)準(zhǔn)的IgA腎病患者25例和健康

17、對(duì)照15例，取其血清，采用親和層析和分子篩分離IgA1，Western-blotting鑒定，取mIgA1，63℃溫育150min，熱聚合為IgA1(aIgA1)。然后各取分別來(lái)自IgA腎病患者和健康對(duì)照的aIgA1(100ug/ml)與小鼠腎小球系膜細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞上清。在有或無(wú)纈沙坦或TNF-α中和性抗體預(yù)處理下，取不同來(lái)源的系膜細(xì)胞上清與足細(xì)胞作用24小時(shí)。細(xì)胞計(jì)數(shù)法和己糖胺酶分析法檢測(cè)足細(xì)胞粘附性的改變，Real-t