1、外源基因或表達(dá)結(jié)構(gòu)的插入位點(diǎn)及整合方式，不僅關(guān)系外源基因的表達(dá)，而且可能引起插入位點(diǎn)突變，影響內(nèi)源基因表達(dá)，是轉(zhuǎn)基因機(jī)理研究和安全性評價的重要內(nèi)容。玉米基因組比擬南芥和水稻等模式植物更為復(fù)雜，而且存在大量的重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座序列。因此，在玉米轉(zhuǎn)基因研究中，外源基因插入位點(diǎn)及整合方式的鑒定更為重要，也更為困難。
　　本實(shí)驗(yàn)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米內(nèi)源光敏色素基因PhyA1、PhyA2和PhyB1的6個不同世代株系和陽性株為材料，經(jīng)特異PC

2、R純合性檢驗(yàn)后，用高效熱不對稱交錯式PCR擴(kuò)增T-DNA整合位點(diǎn)的側(cè)翼序列，分析T-DNA的玉米基因組中的整合規(guī)律，討論其對表現(xiàn)型的影響。所得結(jié)果如下:
　　1.用兩套巢式物分別擴(kuò)增相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因及其啟動子序列片段，表達(dá)載體pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos和pCAMBIA1390-Ubi-PhyB1-T-nos分別轉(zhuǎn)化的T7代株系全部為陽性植株，純合率為100％。表達(dá)載體pTF101.1-Ubi-PhyA

3、1-T-nos轉(zhuǎn)化的T6代株系大部分為陽性植株，純合率為90％。表達(dá)載體pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉(zhuǎn)化的T3代株系純合率為40％。在表達(dá)載體pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化T0代植株中，檢測出2個獨(dú)立的陽性植株，陽性率為5％。
　　2 hiTAIL-PCR和基因組步移擴(kuò)增及序列分析結(jié)果，pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos轉(zhuǎn)化T7代株系、pCAMBIA1390-Ubi-P

4、hyB1-T-nos轉(zhuǎn)化T7代株系、pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos轉(zhuǎn)化T6代株系、pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉(zhuǎn)化T3代株系以及pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化T0代陽性株1和2的T-DNA整合位點(diǎn)，分別位于玉米基因組第1染色體第284557834與284557835堿基、第9染色體第61944355與61944356堿基、第1染色體第26981167與26981168堿基、第6

5、染色體第96491356與96491357堿基、第3染色體第125567445與125567446堿基和第4染色體第98934902與98934903堿基之間。
　　3.根據(jù)上述6個轉(zhuǎn)基因株系或T0代陽性株的T-DNA整合位點(diǎn)，在玉米基因組序列數(shù)據(jù)庫中搜索上下游10 kb以內(nèi)的功能基因序列、重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子序列。結(jié)果表明，pCAMBIA1390-Ubi-hyA1-T-nos和pCAMBIA1390-Ubi-PhyB1-T-nos分

6、別轉(zhuǎn)化T7代株系，pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos轉(zhuǎn)化T6代株系和pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化T0代陽性株2的T-DNA整合位點(diǎn)，上下游10kb范圍未發(fā)現(xiàn)功能基因序列、重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子序列。 pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉(zhuǎn)化T3代株系的T-DNA整合位點(diǎn)下游1050 bp有一編碼WRKY40轉(zhuǎn)錄因子的基因，上游70 kb還有一個功能未知基因。pTF101.1-Ubi-PhyB1

7、-T-nos轉(zhuǎn)化T0代陽性株1的T-DNA整合位點(diǎn)下游20 bp有一編碼精氨酸t(yī)RNA的基因，上游200 bp還有一個基因功能未知基因。
　　4.上述6個轉(zhuǎn)基因株系和T0代陽性株T-DNA左右邊界共12個整合位點(diǎn)，共有4種整合模式:(1) T-DNA整合的斷裂點(diǎn)發(fā)生在邊界序列內(nèi)，整合進(jìn)玉米基因組的T-DNA不附帶表達(dá)載體骨架和填充序列。(2) T-DNA整合的斷裂點(diǎn)發(fā)生在邊界序列以外，整合進(jìn)玉米基因組的T-DNA附帶部分表達(dá)載體骨

8、架序列。(3) T-DNA邊界與玉米基因組序列之間填充進(jìn)一段與表達(dá)載體和玉米基因組均不同源的序列。(4) T-DNA整合的斷裂點(diǎn)發(fā)生在邊界序列以內(nèi)，造成T-DNA邊界序列的缺失。此外，在這12個整合的T-DNA左右邊界序列中，均發(fā)現(xiàn)不同程度的堿基替代和缺失突變。
　　綜上所述，T-DNA在玉米基因組的整合位點(diǎn)和模式是多種多樣的，每一轉(zhuǎn)化事件各不相同。對于T-DNA整合位點(diǎn)接近或重合于功能基因序列的情況，在轉(zhuǎn)基因安全性評價中應(yīng)專門進(jìn)