1、2013年8-9月，四川雅安漢源湖養(yǎng)殖的西伯利亞鱘發(fā)生一種以體表潰瘍、內(nèi)臟出血和心外膜囊腫為特征的傳染病。為明確其病因，本研究從自然發(fā)病魚(yú)的肝、脾和腎進(jìn)行涂片檢查和病原菌的分離、人工感染、分離菌的表型特征和分子生物學(xué)特征的檢測(cè)。肝臟和脾臟涂片均觀察到大量的革蘭氏陽(yáng)性球菌，從患病魚(yú)體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，革蘭氏染色呈G+鏈狀球菌(Ab130920)。人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)分離株能夠引起試驗(yàn)魚(yú)高死亡率，明確了其病原性。生理生化特性檢測(cè)，除對(duì)精氨酸和

2、乳糖反應(yīng)外，與海豚鏈球菌（Streptococcus iniae，S.iniae）(ATCC29178)基本一致;16S rDNA序列(GenBank登錄號(hào):KJ162337)與GenBank中S.iniae16SrDNA序列同源性最高，在以16SrDNA序列及其GenBank中同源性較高的相關(guān)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，分離菌與S.iniae聚為一族;同時(shí)，在基于S.iniae乳酸氧化酶基因的特異性PCR檢測(cè)中，從分離株基因組DNA擴(kuò)增出

3、預(yù)期大小的870 bp條帶，綜合表型特征和分子學(xué)特征檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)而鑒定分離菌Ab130920為S.iniae。藥物敏感性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其對(duì)阿莫西林、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考等抗菌藥物敏感，但對(duì)新生霉素、利福平、氧氟沙星耐藥。
　　為研究其毒力，本試驗(yàn)進(jìn)行了血清殺菌實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)分型、對(duì)EPC細(xì)胞的粘附和侵染實(shí)驗(yàn)、毒力基因檢測(cè)和自然發(fā)病魚(yú)的病理學(xué)損傷研究。結(jié)果表明，菌株在健康西伯利亞鱘的血清中存活率為66.2％，說(shuō)明血清僅能夠殺死部分細(xì)菌，存活細(xì)

4、菌可能隨著血液循環(huán)引起全身性的感染;通過(guò)對(duì)精氨酸和乳糖反應(yīng)以及隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記分析，證實(shí)Ab130920為血清學(xué)Ⅱ型;其對(duì)EPC細(xì)胞的粘附率為3.28％，侵入率為0.08％，證明菌株可粘附在宿主細(xì)胞表面進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)定殖;在對(duì)cpsD、simA、sagA、pdi和scpI等5種S.iniae毒力基因的多重PCR檢測(cè)中，分離菌均擴(kuò)增出相應(yīng)大小的特異性片段，表明其為一毒力較強(qiáng)的菌株，與人工感染實(shí)驗(yàn)的高致病性結(jié)果相佐證;組織病理學(xué)表明

5、，Ab130920引起西伯利亞鱘全身性感染，導(dǎo)致多個(gè)組織器官的出血、細(xì)胞變性和壞死，尤其是肝、腎、脾、心和肌肉的嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為壞死性肝炎、肝血管炎、腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、急性脾炎、心肌炎、桑葚心和骨骼肌的壞死性肌炎;另外鰓、胃腸道、腦和胰腺也出現(xiàn)不同程度的損傷，表現(xiàn)鰓小片炎、胃炎、腸炎、腦膜炎和胰腺?gòu)V泛性出血。
　　為研究其莢膜多糖基因的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)菌株Ab130920和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29178的莢膜多糖基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，

6、并克隆測(cè)序，獲得其序列，并與相關(guān)文獻(xiàn)和GenBank中莢膜多糖基因進(jìn)行多序列比對(duì)，明確莢膜多糖基因的變異性，分析其堿基突變引起相應(yīng)氨基酸的改變。選擇變異性較大的基因cpsD，與相關(guān)文獻(xiàn)和GenBank中的莢膜多糖基因序列進(jìn)行貝葉斯進(jìn)化分析。結(jié)果表明，S.iniae莢膜多糖基因存在變異的有cpsY、 cpsC、cpsD、cpsE、cpsG和cpsY基因，特別是cpsD和cpsE;變異基因在相應(yīng)位點(diǎn)發(fā)生插入、缺失或移碼突變，引起相應(yīng)氨基酸改