1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)俗稱“豬藍(lán)耳病”,是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一,在臨床上以造成懷孕母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎以及仔豬的呼吸系統(tǒng)癥狀為主要特征。本文從PRRS的血清學(xué)調(diào)查、分子遺傳變異、滅活疫苗研制、混合感染和PRRSV傳染性oDNA克隆等方面進(jìn)行了研究和探討。 1、PRRS血清學(xué)調(diào)查與病毒分離鑒定 為了調(diào)查山東

2、地區(qū)PRRS的感染狀況,2004年至2006年從山東各地未免疫PRRS疫苗的豬場(chǎng)采集1,332份血樣,采用IDEXX公司的間接ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,59.5％的血清樣品呈PRRS抗體陽(yáng)性,其中偏遠(yuǎn)農(nóng)村的散養(yǎng)豬場(chǎng)和小規(guī)模豬場(chǎng)只有32.5％的血清樣品呈PRRS陽(yáng)性,然而,從大型規(guī)模化豬場(chǎng)采集的血清樣品中PRRS抗體的陽(yáng)性比例占83.1％。從PRRS陽(yáng)性的豬場(chǎng)樣品中分離到豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),在Marc-145細(xì)

3、胞上呈現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(CPE),但不同PRRSV分離株產(chǎn)生CPE的時(shí)間與類型不盡相同,并且不同分離株的毒力也存在較大差異。本研究結(jié)果表明,PRRS的流行狀況與豬場(chǎng)規(guī)模大小和豬群密度密切相關(guān),并且本地區(qū)豬場(chǎng)中存在不同表型的PRRSV分離株。 2、PRRSV山東分離株分子遺傳變異研究 設(shè)計(jì)了4對(duì)PRRSV特異性引物,分別擴(kuò)增5個(gè)PRRSV山東分離株的ORF5基因、ORF6基因、ORF7基因和Nsp2基因,并克隆至pMD18

4、-T載體,送至公司測(cè)序,采用分子生物學(xué)軟件分析病毒的分子遺傳變異規(guī)律。序列分析表明,5個(gè)分離株ORF5基因的核苷酸序列同源性為88.2％-99.2％,ORF6基因的同源性為94.9％-99.8％,ORF7基因的同源性為93.5％-100％。其中兩株P(guān)RRSV傳統(tǒng)毒株與北美型代表株VR2332的核苷酸序列高度同源,而3株P(guān)RRSV變異株Nsp2蛋白缺失30個(gè)氨基酸,與國(guó)內(nèi)以前報(bào)道的變異株JXA1株高度同源,與VR-2332株同源性相差較大

5、。研究結(jié)果表明,山東省豬場(chǎng)近幾年同時(shí)存在PRRSV傳統(tǒng)毒株和變異株感染,并且近年來(lái),山東PRRSV流行毒株有從傳統(tǒng)美洲型向Nsp2基因缺失變異株演化的趨勢(shì)。 3、PRRS滅活疫苗(SD1株)研究 在對(duì)PRRSV SD1株細(xì)胞生物學(xué)培養(yǎng)特性研究的基礎(chǔ)上,我們對(duì)PRRS滅活疫苗生產(chǎn)工藝進(jìn)行了研究,包括毒種繁殖、滅活方法、乳化工藝、安全檢驗(yàn)與效力檢驗(yàn)等內(nèi)容。將效價(jià)大于107.0TCID50/mL的PRRSV-SD1株病毒培養(yǎng)液

6、用終濃度為0.1％的甲醛于37℃滅活20 h,加入4％吐溫-80作為水相,與油相(按油水比2:1的比例)于膠體磨中乳化而成。疫苗性狀為油包水型,無(wú)菌檢驗(yàn)合格,無(wú)毒副作用及其他不良反應(yīng)。效力試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)血清中和抗體效價(jià)≥1:10時(shí),豬攻毒后表現(xiàn)基本正常,無(wú)不良反應(yīng)。疫苗的免疫有效期可達(dá)6個(gè)月,4℃保存期暫定為12個(gè)月。田間試驗(yàn)和區(qū)域試驗(yàn)表明,母豬免疫后弱仔率、木乃伊胎率、死胎率下降約8％,仔豬成活率升高約10％,免疫豬群的中和抗體陽(yáng)性

7、率(≥1:10)可達(dá)80％以上。 4、從PRRS疑似病料中檢測(cè)PCV2的研究 2005年至2007年期間從山東各地共收集156份PRRS疑似病料(組織和血清),其中102份經(jīng)RT-PCR確定為PRRSV陽(yáng)性。設(shè)計(jì)特異性引物,采用PCR技術(shù),從PRRS疑似病料中檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。結(jié)果顯示,有46份(29.5％)組織病料勻漿(肺、肝、脾、腎和淋巴結(jié))為PCV2型陽(yáng)性,然而,只有32份血清(20.5％)為PCV2

8、陽(yáng)性。其中,PRRS陽(yáng)性病料中PCV2的陽(yáng)性率為33.3％(34/102),而PRRS陰性病料中PCV2的陽(yáng)性率僅為22.2％(12/54)。根據(jù)PCV2開放閱讀框2(ORF2)繪制的遺傳進(jìn)化樹分析表明,本研究中分離的PCV2核苷酸序列同源性在98.3％-100％之間,與國(guó)內(nèi)外其他分離株相比,本地分離株更接近于法國(guó)分離株。研究結(jié)果表明,本地區(qū)PRRS疑似病料中PCV2的陽(yáng)性率較高,而且其感染率在PRRS陽(yáng)性病料和陰性病料中有著明顯差異(

9、P<0.05)。 5、應(yīng)用PRRSV傳染性cDNA克隆構(gòu)建PRRSV-PCV2重組病毒的研究 PRRSV傳染性cDNA克隆的研制成功使我們能夠運(yùn)用反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)病毒的基因組進(jìn)行操作,在體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞,產(chǎn)生帶有新的遺傳標(biāo)記的PRRSV。在本研究中,我們對(duì)運(yùn)用PRRSV傳染性cDNA克隆表達(dá)外源基因進(jìn)行了探討和嘗試。因?yàn)镻CV2是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要致病因子之一,而核衣殼蛋白基因(Capsid prot

10、ein gene,即ORF2 gene)是PCV2的主要結(jié)構(gòu)基因,其編碼的核衣殼蛋白起具有重要免疫原性。在本研究中,我們首先采用PCR擴(kuò)增出PCV2 ORF2基因,然后通過(guò)克隆技術(shù)插入PRRSV傳染性cDNA分子克隆,轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生PRRSV-PCV2重組病毒。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)和免疫熒光技術(shù)在重組病毒感染的細(xì)胞中成功驗(yàn)證了PCV2核衣殼蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步評(píng)估PRRSV-PCV2重組病毒的免疫原性,分別用PRRSV原始野毒和PRRS

11、V-PCV2重組病毒各接種5頭仔豬,另外一組接種Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)液作為對(duì)照組。試驗(yàn)仔豬于第0d和第21d接種兩次,頸部肌肉注射,然后分別于接種后4、7、14、21、28和35d各采血一次,檢測(cè)PRRSV病毒血癥持續(xù)時(shí)間和PRRSV、PCV2抗體水平。結(jié)果顯示,PCV2抗體在接種后21d開始轉(zhuǎn)陽(yáng),至少維持到接種后35d。與PRRSV原始野毒相比,PRRSV-PCV2重組病毒引起的病毒血癥明顯縮短。試驗(yàn)結(jié)果表明,PRRSV能夠作為載